徠卡顯微鏡：熒光顯微鏡介紹
熒光顯微鏡的光學(xué)顯微鏡是一種特殊形式。它使用目標(biāo)波長(zhǎng)的光激發(fā)后發(fā)射光的熒光染料的能力。蛋白質(zhì)的利益可以通過抗體染色或熒光蛋白標(biāo)記的熒光染料標(biāo)記的。它允許一個(gè)單一分子物種的分布的測(cè)定，其量和其在細(xì)胞內(nèi)的本地化。此外，可以進(jìn)行共定位和相互作用的研究，觀察到的離子濃度，使用可逆地結(jié)合染料，如Ca 2 +和呋喃-2和內(nèi)吞作用和胞外分泌的細(xì)胞過程，如觀察。今天，它甚至可以將圖象分的幫助下，熒光顯微鏡的分辨率的顆粒
斯托克斯位移
熒光的一個(gè)重要特點(diǎn)是斯托克斯位移。它描述了一個(gè)令人興奮和發(fā)射的光子的能量水平的差異。由熒光發(fā)射的光子是一個(gè)令人興奮的光子的波長(zhǎng)比更大。這是由于被激發(fā)后的熒光染料，但在此之前發(fā)射的光子的能量釋放到周圍環(huán)境中。由此產(chǎn)生的波長(zhǎng)偏移，使得它可以令人興奮的和出射光之間的區(qū)分。可以被看作是具體特征的分子物種的吸收和發(fā)射的能量。
熒光顯微鏡
圖 1：通過熒光顯微鏡的光路
近年來，發(fā)光二極管（發(fā)光二極管）也被用作光源，用于熒光顯微鏡。由LED發(fā)射的光的波長(zhǎng)取決于用于生產(chǎn)的材料。然而，在大多數(shù)情況下，需要的激發(fā)光濾光片，因?yàn)長(zhǎng)ED通常在一個(gè)相當(dāng)寬的波長(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)射光。
大多數(shù)熒光顯微鏡落射熒光顯微鏡。照明器和物鏡被定位在試件的同一側(cè)，并通過試樣的光不通過。除了激發(fā)和發(fā)射濾光片，分色鏡，需要為這種熒光顯微鏡。甲二向色反射鏡，使目標(biāo)波長(zhǎng)的光通過，而其他波長(zhǎng)的光被反射。過濾器和分色鏡經(jīng)常一起插入在過濾器中的多維數(shù)據(jù)集。
激發(fā)光通過激發(fā)光濾光片和分色鏡。這反映了對(duì)試樣的光通過物鏡。標(biāo)本中的興奮和熒光染料發(fā)出的光子。這個(gè)發(fā)射光線通過客觀的分色鏡。所發(fā)射的光具有適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，并且能夠通過。由試樣反射的激發(fā)光，無法通過二向色鏡，會(huì)被阻塞。如果激發(fā)光能夠通過分色鏡將被阻塞，當(dāng)它到達(dá)發(fā)射濾光片。可以測(cè)量的檢測(cè)器的發(fā)射過濾器的光通過。 在熒光顯微鏡中使用不同類型的過濾器。帶通，長(zhǎng)傳和短通濾波器可以區(qū)分的。傳輸?shù)念l帶的波長(zhǎng)帶通濾波器，而具有更大或更小的波長(zhǎng)的光將被阻止。長(zhǎng)傳和短通濾波器邊緣過濾器。長(zhǎng)通濾波器的長(zhǎng)波長(zhǎng)的光傳輸。與目標(biāo)的截止值以上的波長(zhǎng)的光將無法通過。相比之下，短通濾波器傳輸短的波長(zhǎng)，并阻止長(zhǎng) 圖 3，綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎 圖 4：熒光原位雜交染色體。紅色：TRITC，藍(lán)色：CY5，綠色：FITC 熒光顯微鏡被廣泛使用，并提供了巨大的特異性。的各種技術(shù)使人們有可能以解決不同的問題，甚至規(guī)避，阿貝描述的衍射極限。 可確定的分子物種的本地化與助染色的細(xì)胞器，如細(xì)胞骨架或膜。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM），使得它可以觀察到在該樣本中沒有信號(hào)從外部的焦平面的區(qū)域，并允許光學(xué)切片。全內(nèi)反射顯微鏡（TIRF）是一種技術(shù)，它允許接近到細(xì)胞表面的薄區(qū)域的觀察。在這方面的一個(gè)漸逝場(chǎng)激發(fā)的熒光染料。 觀察一個(gè)分子物種的動(dòng)態(tài)變化的一種技術(shù)是熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）。在一個(gè)受限制的區(qū)域的熒光染料的光漂白和未漂白的分子的擴(kuò)散，進(jìn)入此區(qū)域可以測(cè)量。熒光能量轉(zhuǎn)移（FRET）的顯微鏡，可以進(jìn)行交互研究。一個(gè)興奮的捐助生色團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移到受體熒光激發(fā)它。如果兩者都匯集了非常密切的，這是*可能。如果這些染料被耦合到不同的蛋白質(zhì)，它們只能夠傳遞能量，發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)，如果彼此交互。 技術(shù)，使受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡，地面狀態(tài)消耗（GSD）顯微鏡，單分子和基態(tài)耗盡顯微鏡由單個(gè)分子的回報(bào)（GSDIM），光敏定位顯微鏡（PALM）和隨機(jī)子高分辨率圖像光學(xué)重建顯微鏡（STORM）。子顯微鏡用于這些技術(shù)也被稱為作為nanoscopes，因?yàn)樗麄兘鉀Q在納米尺度的圖像。 圖 5：Pukinje的細(xì)胞，矢狀節(jié)三重標(biāo)記小鼠小腦皮質(zhì)。紅色：anti-calbindin-D28k/Cy3，綠色環(huán)保：，藍(lán)色anti-GFAP/Cy5：赫斯特33258 圖 6：鼠標(biāo)組織切片，自發(fā)熒光，熒光壽命microcsopy（FLIM）
在熒光顯微鏡中的不同的技術(shù)
