徠卡顯微鏡：三維超分辨率GSDIM顯微鏡
蜂窩條塊維持細(xì)胞骨架的軌道在水皰結(jié)構(gòu)沿靶蛋白販運(yùn)。這些細(xì)胞成分的詳細(xì)特征是了解細(xì)胞功能至關(guān)重要。基于單分子定位的*分辨率成像方法已經(jīng)開始把這些小的結(jié)構(gòu)成為關(guān)注的焦點(diǎn)。
GSDIM（地面的狀態(tài)耗盡顯微鏡其次個(gè)別分子回報(bào)）可用于細(xì)胞車廂參與販運(yùn)蛋白質(zhì)，如高爾基體和微管網(wǎng)絡(luò)，以獲得詳細(xì)的關(guān)鍵洞察。隨著新的的3D GSDIM技術(shù)（徠卡SR GSD 3D），這些結(jié)構(gòu)不僅解決橫向，而且在第三個(gè)維度。的原理是基于使用的光學(xué)散光，以確定個(gè)別的熒光染料的精確的側(cè)向和軸向位置。這種技術(shù)的另一個(gè)巨大優(yōu)勢(shì)是使用標(biāo)準(zhǔn)熒光和普通染色協(xié)議的可能性。易于使用GSD向?qū)Ш?jiǎn)化的三維圖像重建和處理。這種方法允許蜂窩結(jié)構(gòu)具有橫向分辨率下降到20納米，約70nm的軸向分辨率的三維成像。
圖 1：個(gè)別熒光基團(tuán)的三維定位。
高功率激光的徠卡SR GSD 3D系統(tǒng)可以切換廣泛的熒光染料，可以在很短的時(shí)間，搜集了大量的光子熒光抗體和Alexa的染料，也用于古典螢光允許研究人員使用一套。高功率激光物鏡具有160倍的放大倍率，另外單分子在高分辨率的精確定位。對(duì)于這樣的精度，需要一段較長(zhǎng)的時(shí)間。成像期內(nèi)非漂流樣本的前提是通過相撲（禁止運(yùn)動(dòng)）階段的技術(shù)，*大限度地減少橫向漂移不到20 nm/10分鐘。
在三維可視化車廂蜂窩物流
徠卡SR GSD 3D系統(tǒng)是一種新型的本地化顯微鏡方法，在第三維度的高分辨率顯示細(xì)胞車廂。要了解運(yùn)輸過程中的極化上皮細(xì)胞不同的細(xì)胞器的精確定位參與販運(yùn)蛋白質(zhì)是必要的。利用高分辨率的GSD顯微鏡未能分析高爾基體基質(zhì)蛋白GM130，線粒體的ATP合成酶ATP的-2B和detyrosinated的的微管（微管蛋白detyr）。MDCK細(xì)胞的野生型細(xì)胞，用冰冷的甲醇或4％PFA固定于蓋玻片上培養(yǎng)一天。阻止將細(xì)胞用1％牛奶粉末或1％BSA（牛血清白蛋白）在PBS + +（PBS 1 mM的CaCl 2的和1 mM的MgCl 2的）和免疫染色，進(jìn)行通過使用抗體針對(duì)GM130，ATP-2B或detyr微管蛋白。一抗標(biāo)記抗體Alexa647耦合，用100mM的MEA（β-巰基乙胺）的PBS作為包埋劑。高爾基體標(biāo)記的圓形結(jié)構(gòu)GM130面臨的高爾基體腔中（圖2A）的*分辨率。除了2D圖像的詳細(xì)信息的落射熒光圖像相比，第三維清楚地定義了使用的顏色漸變，該值指示從0-800 nm的z軸在此隔室中的細(xì)胞定位。雖然線粒體和微管中的2D，GSD圖像（圖2B），已經(jīng)很好地解決三維GSD*分辨率圖像顯示線粒體定位在接近微管，表明這些細(xì)胞器和細(xì)胞骨架的軌道的移動(dòng)。
蛋白質(zhì)運(yùn)輸和上皮細(xì)胞分化
極性的上皮細(xì)胞的功能的器官的先決條件。他們建立一個(gè)單分子層的外表面上的臟器，器官和環(huán)境之間提供了一個(gè)阻擋和交換系統(tǒng)。上皮細(xì)胞的極化結(jié)構(gòu)，其特征在于由兩個(gè)不同的域的質(zhì)膜，心尖朝向域的器官腔體和細(xì)胞 - 細(xì)胞和細(xì)胞 - 細(xì)胞外基質(zhì)的接觸發(fā)生時(shí)，基底域。這兩種膜域分隔緊密連接，并表現(xiàn)出不同的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分。為了保持這種極性，上皮細(xì)胞演變的一個(gè)非常具體的極化分揀他們的物鏡膜蛋白質(zhì)和脂類。
根尖蛋白質(zhì)的分類需要的各種不同的途徑到細(xì)胞表面的各種排序的信號(hào)。糖基肌醇（GPI）錨，以及參與的N和O-聚糖識(shí)別作為根尖排序信號(hào)。分選通路由所運(yùn)輸?shù)闹さ鞍椎挠H合性，可以細(xì)分。因此，存在的脂質(zhì)筏依賴和非依賴途徑。因此，蛋白質(zhì)分離成不同的囊泡群體在高爾基體網(wǎng)絡(luò)（TGN）或后高爾基體隔室。
分揀過程涉及許多蛋白質(zhì)，是必不可少的正確交付貨物的蛋白質(zhì)。一個(gè)重要的排序受體是半乳糖凝集素-3。它可以由于它們的糖基化的具體貨物綁定到傳輸?shù)秸_的質(zhì)膜。此外，細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白微絲和微管形成的軌跡在這個(gè)過程中所涉及的分泌泡和細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)。都需要特別長(zhǎng)的段落在細(xì)胞內(nèi)的微管。它們包括α-和β-微管蛋白的聚合二聚體的亞基。翻譯后修飾，如微管蛋白的酪氨酸殘基，其中α-微管蛋白的C端結(jié)構(gòu)域添加或刪除tyrosination detyrosination，需要正確交付貨物的頂膜。
高度解決GSDIM圖像描繪沿著單個(gè)分子的分布這些修改，并可以解決細(xì)胞成分中所涉及的極化蛋白販運(yùn)詳細(xì)。
三維GSD的原理
衍射障礙限制了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的成像分辨率的橫向尺寸在200-300納米和500-800納米的軸向尺寸，留下許多細(xì)胞器和結(jié)構(gòu)無(wú)法解決的。許多蜂窩結(jié)構(gòu)要小得多，如高爾基體潴像煎餅間隔排列<100 nm的分開，ATP合酶相隔間距10納米內(nèi)線粒體膜，微管是由二聚亞基形成空心棒25納米外徑。一些方法已被用來(lái)克服這個(gè)衍射極限，以二維的*分辨率顯微鏡技術(shù)，如受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡，光活化定位顯微鏡（PALM），隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（風(fēng)暴），其次是個(gè)別的基態(tài)耗盡分子的回報(bào)（GSDIM）顯微鏡。直接隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（dSTORM）的*近的3D GSDIM顯微鏡（徠卡SR GSD 3D），蜂窩室就可以解決的第三個(gè)維度。
在dSTORM GSDIM顯微鏡的熒光的確切位置，確定基于時(shí)空分離的原則。這就需要開關(guān)之間的打開和關(guān)閉狀態(tài)，然后順序讀出的熒光染料。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)的開始，大部分的熒光染料轉(zhuǎn)移到一個(gè)長(zhǎng)期生活的黑暗狀態(tài)（關(guān)閉狀態(tài)），通過采用高強(qiáng)度激光。只有單分子將返回到ON狀態(tài)隨機(jī)切換回之前的黑暗狀態(tài)，并發(fā)出熒光的時(shí)間很短。這些分子的熒光信號(hào)周期，從暗到亮的狀態(tài)，回到黑暗狀態(tài)，隨著時(shí)間的推移被記錄。*后，*分辨率圖像重建的圖像由數(shù)千。
將被描繪成一個(gè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）幾百納米大小的熒光信號(hào)。但是可適應(yīng)的PSF /調(diào)整的一個(gè)兩維高斯函數(shù)本地化的分子的確切位置。分子的位置的精確度依賴于信號(hào)強(qiáng)度，即收集的光子的數(shù)量。的分辨率是通過增加檢測(cè)時(shí)間上彼此分離的單熒光斑點(diǎn)。
為了使定位在z方向上的單熒光團(tuán)，用于引入到顯微鏡的成像路徑中的柱面透鏡的散光效果。其結(jié)果是熒光點(diǎn)的橢圓率和方向的變化取決于其在z維度的位置，從而使三維重建。當(dāng)在焦平面的熒光，圖像出現(xiàn)一輪。當(dāng)熒光團(tuán)是下面的重點(diǎn)，在垂直方向上的圖像的光點(diǎn)形狀是細(xì)長(zhǎng)的，反之，高于的焦點(diǎn)位置時(shí)，它是當(dāng)場(chǎng)在水平方向上延伸。
A）
B）
圖 2：廣角鏡，2D GSDIM和3D GSDIM顯微鏡的比較。
）MDCK細(xì)胞培養(yǎng)蓋玻片，固定和高爾基體基質(zhì)蛋白gm130/Alexa647免疫染色。比例尺條為2μm
B）的蓋玻片上生長(zhǎng)的MDCK細(xì)胞中線粒體的ATP合成酶固定和染色使用抗ATP-2B使用一個(gè)反detyr的微管蛋白抗體的抗體和微管。兩人被打成Alexa647耦合二次抗體。比例尺條為2μm。漸變的顏色表示的x軸0-800納米。
展望
*分辨率GSDIM的有助于闡明本地化的組件中所涉及的更詳細(xì)的極化蛋白販運(yùn)，因此揭示以前懸而未決的運(yùn)輸機(jī)制。三維GSD的圖像顯示了在常規(guī)落射熒光圖像分辨率提高，而且，它提供了，這不是所提供的2D圖像的3D信息。使用在三維的這個(gè)*分辨率技術(shù)，這將有可能監(jiān)測(cè)蛋白運(yùn)輸通路的多個(gè)組件，如運(yùn)輸小泡，在未來(lái)。徠卡SR GSD 3D是一個(gè)新的*分辨率顯微鏡多應(yīng)用平臺(tái)，包括TIRF，廣角和*分辨率更深入的了解，使基本過程在細(xì)胞內(nèi)。