近四分之一個(gè)世紀(jì)以來(lái)已通過(guò)引入原位雜交的方法檢測(cè)和研究染色體和細(xì)胞的DNA序列在文獻(xiàn)中出現(xiàn)的*個(gè)研究文章。 然而，在過(guò)去的15年里，發(fā)生了一場(chǎng)**，光鏡下通過(guò)熒光技術(shù)的發(fā)展，允許*的輕松，精密，準(zhǔn)確定位，識(shí)別和生物醫(yī)學(xué)樣品的基因構(gòu)成數(shù)據(jù)記錄。

通過(guò)同時(shí)使用多個(gè)熒光色原位雜交的力量得以極大地延長(zhǎng)。 多色熒光原位雜交（FISH），在其*簡(jiǎn)單的形式中，可以用于識(shí)別盡可能多的雜交中使用的不同的熒光團(tuán)標(biāo)記的功能。 不僅使用單一顏色，而且顏色的組合，有更多的標(biāo)記的功能可以被同時(shí)檢測(cè)到單個(gè)細(xì)胞中，使用數(shù)字成像顯微鏡。

圖1中顯示的是一個(gè)典型的多色熒光原位雜交標(biāo)本。 正常男性淋巴細(xì)胞雜交FITC標(biāo)記生物素標(biāo)記Chr2l的的的CHRY探頭和CY3高辛標(biāo)記Chrl3的的和CHRY探頭。 在左上角的一個(gè)形象的DNA的細(xì)胞核用DAPI染色的，采取了使用DAPI過(guò)濾器集。 右上角是一個(gè)圖像的Chr21 CHRY與FITC染色，用一個(gè)FITC過(guò)濾集。 在較低的左邊是一個(gè)形象的Chrl3 CHRY CY3染色，用CY3過(guò)濾器設(shè)置拍攝。 在右下角的圖像加入彩色合成圖像顯示所有物鏡染色體的顏色。 由馬薩諸塞州弗雷明漢，綜合遺傳學(xué)，添博士Houseal，提供標(biāo)本。

多色熒光原位雜交，與數(shù)字成像技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)，今天提供*的功能的多個(gè)核酸序列的電池組件，染色體和基因的分析的非同位素檢測(cè)。

在一個(gè)不同的，通常較長(zhǎng)的波長(zhǎng)的現(xiàn)象，即在一個(gè)光波長(zhǎng)激發(fā)一種化學(xué)發(fā)光，熒光，用于在整個(gè)生命科學(xué)的研究各種各樣的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)。 探頭和顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致的熒光技術(shù)的快速發(fā)展，在過(guò)去的十年。

該評(píng)論文章將覆蓋FISH技術(shù)的基本知識(shí)的局限性，研究人員已經(jīng)面臨多年來(lái)在使用FISH，*近的事態(tài)發(fā)展在硬件，軟件，探針，試劑技術(shù)發(fā)展的影響，以及在該領(lǐng)域目前的研究結(jié)果。 FISH的技術(shù)開(kāi)始擴(kuò)大*出純理論研究，為臨床診斷設(shè)置的新發(fā)展，也將被審查。

FISH技術(shù)概述

使用FISH基因組學(xué)，細(xì)胞遺傳學(xué)，產(chǎn)前研究，腫瘤生物學(xué)，輻射標(biāo)簽，基因定位，基因擴(kuò)增，基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究正在迅速增長(zhǎng)。 原則上，技術(shù)是相當(dāng)簡(jiǎn)單的。

標(biāo)識(shí)，雜交反應(yīng)，或標(biāo)簽，物鏡基因組序列，因此它們的位置和大小，可以研究。 適當(dāng)情況下，染色體特異性探針的DNA或RNA序列，首先與記者的分子標(biāo)記，通過(guò)熒光顯微鏡，這是后來(lái)查明。 標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交到中期染色體或間期核的投影片上。 洗滌和信號(hào)放大后，試樣的報(bào)告分子篩選通過(guò)熒光顯微鏡觀察。

FISH形態(tài)學(xué)和基因組結(jié)構(gòu)，可以非常精確的空間分辨率。 該技術(shù)具有快速，簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)，并提供了巨大的探頭穩(wěn)定性。 一個(gè)特定的物種的基因組中，可確定整個(gè)染色體，染色體的特定區(qū)域，或單拷貝的**序列，這取決于所用的探針。

上一頁(yè)限制

直到*近，F(xiàn)ISH是有限的硬件，軟件，試劑，探針技術(shù)，并參與實(shí)施該技術(shù)的成本。

市售顯微鏡硬件優(yōu)化多色FISH是不可用的，直到20世紀(jì)90年代中期。 在此之前，顯微鏡FISH應(yīng)用程序進(jìn)行自定義。 沒(méi)有被設(shè)計(jì)成大多數(shù)光學(xué)顯微鏡檢測(cè)FISH信號(hào)中固有的低光水平。 作為基因組的分辨率的技術(shù)已急劇增加，在顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)的要求已進(jìn)一步增大。 多個(gè)波長(zhǎng)之間色差一直是一個(gè)問(wèn)題。 對(duì)于多色進(jìn)行具體分析，所有的鏡頭，包括集電極鏡頭，不得不被色校正。 此外，落射熒光光源均勻照明難以對(duì)齊。

多色熒光原位雜交圖像分析使用（一）單個(gè)濾波器的多維數(shù)據(jù)集需要的各種信號(hào)的隔離，或（b），利用一個(gè)激勵(lì)濾光輪與多路徑的二色性和屏障過(guò)濾器。 *近的事態(tài)發(fā)展過(guò)濾技術(shù)糾正了一些以前遇到的問(wèn)題，通過(guò)光學(xué)失調(diào)引起的個(gè)別濾光塊的機(jī)械開(kāi)關(guān)。 激發(fā)濾光片輪，可以有效地用于多通分色和阻隔過(guò)濾器使用三種顏色，采用每種顏色單獨(dú)激發(fā)濾光片沒(méi)有注冊(cè)移位。 但是，對(duì)于*過(guò)三種顏色，單通濾波器仍然可以使用。

高速彩色膠片或CCD（ 電荷耦合器件 ）相機(jī)，用于收集數(shù)據(jù)和色彩保真度問(wèn)題。 此外，疊加的圖像的過(guò)程中，的收購(gòu)不同顏色與不同的探針在一個(gè)單一的試樣的限制。

成像軟件，可以定量分析樣品熒光試劑也很有限，因?yàn)楝F(xiàn)有的圖像分析系統(tǒng)，優(yōu)化工作與熒光樣品。 可視化分析是勞動(dòng)密集的，往往是主觀的程序，并在某些情況下，熒光的樣品的分析而使用*的熒光成像能力是困難的和不確定的。 研究人員通常必須有一個(gè)軟件開(kāi)發(fā)人員創(chuàng)建自己的內(nèi)部圖像分析軟件。

所用試劑和探針本身沒(méi)有足夠的所有應(yīng)用程序。 例如，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)雜交的效率降低隨探針大小，創(chuàng)建通過(guò)熒光顯微鏡觀察，可觀察到顯著的限制。 不同顏色的熒光染料的數(shù)量是有限的，和染料的光穩(wěn)定性差。 但由聯(lián)邦政府資助的人類基因組計(jì)劃的熒光染料技術(shù)和分拆技術(shù)的新發(fā)展，現(xiàn)在有一定的影響。 有所有的人染色體，越來(lái)越多的新的基因的特異性探針的探針可用。 原位雜交試劑盒和熒光標(biāo)記的探針在商業(yè)上可從幾家公司。

成本是另一個(gè)主要障礙。 由于沒(méi)有市售FISH系統(tǒng)市場(chǎng)上，研究人員組裝定制的系統(tǒng)，包括試劑，探針，顯微鏡，成像硬件，軟件，數(shù)據(jù)分析和報(bào)告能力。 同時(shí)要執(zhí)行的多色FISH復(fù)雜的圖像分析可能花費(fèi)20萬(wàn)美元，大多數(shù)臨床研究人員不容易接觸到的一筆研究員向上。 其結(jié)果是，許多研究的科學(xué)家們希望在他們的實(shí)驗(yàn)室使用FISH被禁止這樣做。

FISH已成為廣泛使用

許多硬件和軟件制造商已經(jīng)開(kāi)發(fā)出的方法來(lái)創(chuàng)建自定義系統(tǒng)的負(fù)擔(dān)得起的商業(yè)替代品。 發(fā)達(dá)國(guó)家的許多公司和實(shí)驗(yàn)室從事FISH類合作精神，讓新的突破發(fā)展。 作者將引用在自己的經(jīng)驗(yàn)作為例子，這些類型的系統(tǒng)的發(fā)展。

構(gòu)成的系統(tǒng)中使用，在美國(guó)，它提供了一個(gè)中等價(jià)位的FISH系統(tǒng)研究，從一些廠家和依賴于圖像分析軟件，顯微鏡硬件及配件的*新發(fā)展。 臨床研究實(shí)驗(yàn)室會(huì)發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)可用于各種各樣的應(yīng)用。 該系統(tǒng)提供了集成和自動(dòng)化的*終處理臨床測(cè)試卷。

軟件系統(tǒng)所示，這里是MultiFluor（TM）多參數(shù)成像軟件（生物檢測(cè)系統(tǒng)），在Microsoft?Windows（微軟，華盛頓州貝爾維尤）為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，可以檢測(cè)，分析，多色顯示的結(jié)構(gòu)和分子功能FISH樣品。 分析的時(shí)間和準(zhǔn)確性得到改善，通過(guò)關(guān)聯(lián)測(cè)量在每個(gè)樣品中的各種波長(zhǎng)的多個(gè)功能。 該系統(tǒng)有利于圖像采集，圖像存儲(chǔ)，數(shù)據(jù)庫(kù)管理，顯微鏡自動(dòng)化控制，全功能的圖形化數(shù)據(jù)分析。

如圖2所示MultiFluor軟件數(shù)據(jù)審查畫(huà)面。 用戶也可以檢查圖像和相應(yīng)的數(shù)據(jù)一起，和關(guān)聯(lián)從多個(gè)顏色（波長(zhǎng)）的交互式圖形繪制工具，包括直方圖，散點(diǎn)圖等，這里使用各種多參數(shù)數(shù)據(jù)，多個(gè)數(shù)據(jù)圖表一起顯示所選擇的多彩色的圖像設(shè)置的小區(qū)（DAPI染色細(xì)胞核，F(xiàn)ITC-ChrX，CY3-CHRY，CY5 Chr2l的示出），以及與原始數(shù)據(jù)表中所示的測(cè)量。

FISH研究人員可以自動(dòng)捕捉多種波長(zhǎng)和多個(gè)焦平面的圖像，多色FISH探針可視化，注釋和圖像打印出來(lái)，并存儲(chǔ)和檢索大量的彩色圖像數(shù)據(jù)集。 多色熒光原位雜交中期染色體進(jìn)行分析，包括基因定位， 比較基因組雜交 （CGH）的比率，和核型的產(chǎn)生。 用戶選擇的地區(qū)，可以掃描和分析樣品。 該軟件的自動(dòng)對(duì)焦操作，在多個(gè)波長(zhǎng)上獲取圖像，記錄細(xì)胞的滑動(dòng)位置，并測(cè)量多個(gè)功能，包括探頭計(jì)數(shù)，熒光強(qiáng)度，和細(xì)胞形態(tài)計(jì)量學(xué)。 可以從多種波長(zhǎng)的多個(gè)功能相關(guān)。

該系統(tǒng)的另一個(gè)特點(diǎn)是其工作能力與聯(lián)網(wǎng)的個(gè)人計(jì)算機(jī)（PC）。 在一個(gè)典型的設(shè)置，一臺(tái)PC機(jī)連接相機(jī)和顯微鏡硬件上線的分析站。 這臺(tái)電腦處理的圖像采集和瞬時(shí)分析。 其他電腦服務(wù)復(fù)審站*臺(tái)PC所產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行分析，或進(jìn)行專門(mén)的分析脫線。

軟件允許所有圖片要顯示的組件在生動(dòng)的偽多色同時(shí)成像。 例如，圖像，同時(shí)四色實(shí)驗(yàn)，用DAPI（藍(lán)色），F(xiàn)ITC（綠色），CY3（紅色），F(xiàn)ITC-CY3（黃色）的組合都可以被單獨(dú)顯示，或相結(jié)合，以形成彩色復(fù)合圖像（在圖1中）。 每個(gè)圖像可以以交互方式增強(qiáng)揭示興趣特征。 此外，很容易創(chuàng)建直方圖，散點(diǎn)圖，試算表，線圖，以及其他形式的數(shù)據(jù)制表和審查通過(guò)軟件（圖2）。 *后，數(shù)據(jù)保存在一個(gè)方便的流行的數(shù)據(jù)庫(kù)格式，可以存儲(chǔ)為T(mén)IFF，JPEG，GIF，或其他文件。

EPI-照明

自動(dòng)顯微鏡硬件也是系統(tǒng)的一部分。 Optiphot和以后的模型顯微鏡系統(tǒng)（尼康儀器有限公司，梅爾維爾，紐約），具有自動(dòng)化，計(jì)算機(jī)驅(qū)動(dòng)的XYZ階段和對(duì)焦系統(tǒng)，存儲(chǔ)每個(gè)對(duì)象的坐標(biāo)。因此，重要的細(xì)胞和染色體位點(diǎn)可以被立即召回在顯微鏡幻燈片簡(jiǎn)單地搬遷細(xì)胞按鈕上點(diǎn)擊鼠標(biāo)，讓更廣泛的顯微鏡目視檢查或?qū)彶椤?/span>

其中*重要的顯微鏡系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是FISH的應(yīng)用程序設(shè)計(jì)的照明裝置的開(kāi)發(fā)。Quadfluor（TM）和后來(lái)的模型落射熒光照明（尼康儀器公司）接受四個(gè)熒光濾光塊，大幅提高亮度和對(duì)比度，這是重要的好處，研究人員用多種熒光染料。

照明，進(jìn)行FISH和其他*的熒光技術(shù)的研究人員可以自由工作沒(méi)有停下來(lái)更換過(guò)濾器立方體，具有四個(gè)或更多不同的探針。 ，是用于切換的四個(gè)過(guò)濾器中的一個(gè)非常精確的線性滑動(dòng)件的平滑移動(dòng)，確保出色的圖像配準(zhǔn)。

該過(guò)濾器的多維數(shù)據(jù)集提供更高的亮度和非常高的對(duì)比度通過(guò)勵(lì)磁機(jī)，分色，節(jié)流閥過(guò)濾技術(shù)的使用;內(nèi)部輕莫名其妙;節(jié)流閥過(guò)濾器的高精度斜的安裝角度和專有的抗反射涂層。 此外，落射熒光照明器可以容納在一個(gè)時(shí)間中的四個(gè)立方體用于分離不同的熒光信號(hào)，或者可以用于多頻帶濾波器立方體的一些熒光染料同時(shí)圖像。

高傳輸?shù)奈镧R也是必不可少的成像分鐘染色體上的利益。 CFI-60 plan fluor物鏡（尼康儀器公司）的光水泥高透光涂層，以允許更廣泛的波長(zhǎng)范圍和明亮的圖像。 物鏡是自由的色彩和球面像差，并提供極高的對(duì)比度和低背景的自發(fā)熒光。

其他電腦控制的顯微鏡配件，以創(chuàng)建*的電動(dòng)系統(tǒng)，這將是模塊化和更負(fù)擔(dān)得起的研究和臨床應(yīng)用目前正在開(kāi)發(fā)的幾個(gè)廠家。 相機(jī)是該系統(tǒng)的另一個(gè)重要的考慮因素。 圖像可以使用數(shù)字CCD或愈演愈烈攝像機(jī)的收購(gòu)。 在系統(tǒng)中的關(guān)鍵因素是他們有能力執(zhí)行而不犧牲保真度低光成像。 通過(guò)適當(dāng)?shù)能浖?，可以自?dòng)設(shè)置相機(jī)的設(shè)置，通過(guò)全自動(dòng)化的顯微鏡的精度和易用性。

癌癥，產(chǎn)前，產(chǎn)中和生物學(xué)研究

這里描述的FISH系統(tǒng)，可以訪問(wèn)到更多的比舊的，定制系統(tǒng)的研究人員，正在進(jìn)入更廣泛地使用在癌癥研究，病理學(xué)，遺傳學(xué)，發(fā)育生物學(xué)。 在他們的應(yīng)用程序間期細(xì)胞多色探測(cè)器點(diǎn)計(jì)數(shù)，免疫，細(xì)胞形態(tài)學(xué)，DNA含量的分析。

該系統(tǒng)是在使用測(cè)試畸變染色體拷貝數(shù)，總DNA含量的相關(guān)性，與膀胱腫瘤。 在出生前的研究中，該系統(tǒng)可用于測(cè)試在產(chǎn)前唐氏綜合征，特納綜合征，克氏綜合征，以及其他的缺陷，包括相關(guān)聯(lián)的間期核中的anneuploidies。 在細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)的研究中，該系統(tǒng)可用于映射的存在和相對(duì)分布的細(xì)胞表面標(biāo)志物，例如受體，胞質(zhì)蛋白標(biāo)志，包括細(xì)胞骨架蛋白和特定的基因的信使RNA。

診斷潛力

在過(guò)去的十年半，研究人員已經(jīng)知道，F(xiàn)ISH技術(shù)具有非凡的潛力，不僅為純理論研究，但作為一種工具，產(chǎn)前診斷，細(xì)胞遺傳學(xué)，腫瘤評(píng)估等領(lǐng)域的臨床診斷中使用。 缺乏一個(gè)高層次的，價(jià)格適中的系統(tǒng)，不僅放慢了速度FISH已成為大多數(shù)研究者，但也阻止這種不可避免的擴(kuò)張技術(shù)的輔助診斷的醫(yī)療保健設(shè)置。

在此系統(tǒng)中的*重要的后果之一是，它可以提供高級(jí)別的結(jié)果，不僅成本高，自定義配置的系統(tǒng)能夠提供在過(guò)去。 將FISH不僅要更廣泛的生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，而且成為患者的直接需要的夢(mèng)想可能會(huì)在不太遙遠(yuǎn)的將來(lái)成為現(xiàn)實(shí)。