徠卡顯微鏡的新型光學(xué)結(jié)算方法允許整個組織的深層成像
圖像整體無腦切片？ 無需重建研究神經(jīng)回路？ 在不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子分型？ 了解大腦分子的分辨率和全球范圍內(nèi)一直面臨著挑戰(zhàn)。
小說CLARITY方法，由Deisseroth實驗室，斯坦福大學(xué)，美國開發(fā)，推動深部組織的成像大步前進(jìn)的障礙。通過使老鼠大腦光學(xué)透明，同時保留了原生的分子結(jié)構(gòu)，它現(xiàn)在很容易可以調(diào)查亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和生物分子甚至整個完整的器官的配合物。
圖1：三維澄清的小鼠大腦的渲染（Chung等人2013）。
腦成像方法至今
**為止，大腦的映射可能只在有限的方式。 由于光散射的組織，常規(guī)的深部組織成像由多光子顯微鏡被限制為約1mm的組織深度。 調(diào)查位于市中心大腦結(jié)構(gòu)和蜂窩網(wǎng)絡(luò)時，樣品必須切片，研究了小卷。 單個神經(jīng)元的預(yù)測，需要遵循跨多個切片樣本。這是精心設(shè)計的。 新的工具正在不斷開發(fā)：自動切片方法減少繁瑣的工作，盡量減少組織損傷，以及新穎的軟件便于分析和重建。 然而，重建可能不總是可能的或足夠的神經(jīng)元回路的詳細(xì)分析。 使用有機(jī)溶劑的新的光學(xué)信息交換方法降低光散射和圖象更深的組織。 但這些方法離開脂質(zhì)雙層完好無損，那么他們?nèi)匀怀洚?dāng)擴(kuò)散屏障。 光與大分子的整裝染色方法的普及率仍然有限。
如何實現(xiàn)大腦清晰
CLARITY（ 縮寫為清除脂質(zhì)交換丙烯酰胺雜交剛性成像/免疫染色/原位雜交，組織相容水凝膠 ）是簡單，因為它是輝煌的。 完整的組織被轉(zhuǎn)化為水凝膠組織的混合體。 類似于石化或僵化，組織的物理結(jié)構(gòu)保持完好，并能防止崩解。 光散射脂質(zhì)被去除，而蛋白質(zhì)和核酸被保留，因為它們被共價連接到所述水凝膠的網(wǎng)格。
在*步驟中，所述組織是注入的丙烯酰胺/雙丙烯酰胺，甲醛和一個熱敏啟動器，在4℃（圖2）。 甲醛交聯(lián)的組織并共價連接的單體的水凝膠的蛋白質(zhì)和核酸。 脂類和生物分子缺乏官能團(tuán)不結(jié)合，因此，可以被刪除。 只有8％的蛋白質(zhì)是通過此方法失去了（相對于25?40％與傳統(tǒng)的定影和增溶）。 聚合是通過升高溫度至37℃。觸發(fā) 組織現(xiàn)在是一個水凝膠混合。 網(wǎng)格支持組織結(jié)構(gòu)及其納米孔允許大分子進(jìn)入。（本文來源：徠卡顯微鏡的新型光學(xué)結(jié)算方法允許整個組織的深層成像）
脂雙層是由電泳組織清算系統(tǒng)（ETC）除去。 在一個特制的電泳室，樣品被放置在一個離子型去污劑（4％SDS，十二烷基硫酸鈉）和一個施加電場。 高電荷離子的SDS膠束去除脂類積極。 ETC具有上述標(biāo)準(zhǔn)的有機(jī)溶兩大優(yōu)勢：
它不解渴熒光像許多有機(jī)溶劑。
去除脂類的快。 洗滌劑的被動擴(kuò)散將需要長達(dá)幾個月徹底去除脂肪。
通過安裝澄清大腦中像甘油或FocusClear一個折射率指定的解決方案?的完整的大腦變得完全透明，并準(zhǔn)備進(jìn)行成像（圖2B）。
圖2：凈度方法的描述：步驟1：組織是在4℃下注入丙烯酰胺/雙丙烯酰胺，甲醛和一個熱敏啟動器 步驟2：甲醛交聯(lián)的組織并共價連接的單體的水凝膠的蛋白質(zhì)和核酸。 脂雙層是由電泳組織清算系統(tǒng)（ETC）除去。
整個成像的大腦
所有傳統(tǒng)的激光掃描顯微鏡技術(shù)是適合成像的凈度處理的組織，因為每個激發(fā)和發(fā)射波長可以穿透深入到組織中。
成像深度主要受限于物鏡的工作距離。 3.6毫米的客觀需要兩個大腦掃描：*背側(cè)半，然后腹側(cè)。 遠(yuǎn)距離的物鏡，使圖像在一氣呵成的整體器官。 在神經(jīng)科學(xué)學(xué)會2013年會上，徠卡呈現(xiàn)*新的目標(biāo)發(fā)展：一個特殊的CLARITY目標(biāo)與機(jī)動修正衣領(lǐng)設(shè)計為全器官成像的*大成像深度，并與將在2014年成為可用的*高分辨率。
成像技術(shù) | 一般原則 | 優(yōu)點 | 限制 |
單光子共聚焦顯微鏡 | 通過共焦激光共聚焦針孔去除失焦的光實現(xiàn) |
|
|
雙光子顯微鏡 | 通過激勵的大約兩倍的波長的兩個光子 - 和一半的能量 - 必要單光子激發(fā)。 無針孔必需的。 |
|
|
表1：適用于CLARITY成像技術(shù)。
新的可能性的世界
是什么讓CLARITY如此令人興奮的是，你可以調(diào)查任何你想要在一個單一的大腦。 蛋白質(zhì)復(fù)合物，基因表達(dá)分析，神經(jīng)回路 - 你不必來決定你想看到什么。 看著這一切，一前一后。
納米多孔水凝膠網(wǎng)狀透氣是大分子，并允許探頭的快速擴(kuò)散。 抗體染色容易，即使是在多輪。 混合的穩(wěn)定框架允許抗體被淘汰用SDS。 相反，使用有機(jī)溶劑的常規(guī)方法洗脫，隨后染色的熒光是不滅的。 即使在連續(xù)3輪染色和去染色，沒有損失圖像質(zhì)量（圖3和視頻）。
因此能夠遵循通過大腦軸突突起長距離。 顯示配對前和突觸后蛋白的共定位甚至允許單個突觸的調(diào)查。 并采用經(jīng)典的熒光顯微鏡后，該組織仍然適用電子顯微鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)更加緊密。
該方法不限于新鮮的腦組織。 它也成功地用于長期固定的人尸檢腦組織或斑馬魚胚胎，開啟了新的可能性，研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病，或胚胎發(fā)育。
凈度給出了其結(jié)構(gòu)和分子信息，并添加到大規(guī)模的完整的生物系統(tǒng)的理解。 總之，清晰度***的基礎(chǔ)研究。
圖3：小鼠海馬顯示EYFP表達(dá)神經(jīng)元（綠色），小清蛋白陽性神經(jīng)元（紅色）和GFAP（藍(lán)色）（Chung等人2013年）的三維視圖。