徠卡顯微鏡單細(xì)胞分析激光顯微切割后
Morbus (M.) 得老年癡呆癥后， M.Parkinson是第二個(gè)*常見的進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病。 前的*初癥狀顯現(xiàn)出來(lái)，高達(dá)70％的中腦多巴胺釋放的神經(jīng)元已經(jīng)死亡。 生物學(xué)博士。 哼哼。 福爾克施勞德拉夫（德國(guó)烏爾姆大學(xué)的一般生理研究所）用現(xiàn)代激光顯微切割的方法來(lái)從M.Parkinson患者為了獲得分子洞察疾病采取驗(yàn)尸組織標(biāo)本分離和分析細(xì)胞。
M.Parkinson研究
M.Parkinson的特征標(biāo)志是多巴胺能神經(jīng)元在中腦的惡化，特別是在黑質(zhì) （SN，黑色物質(zhì)）。不同的原因和這種疾病的形式已經(jīng)確定。 在基因家族形式的情況下，例如，它一直未能識(shí)別出具有分枝Parkinson因果影響的各種基因。 但是，我們?nèi)匀徊恢朗欠袼邢嚓P(guān)的基因已被確定，或者他們對(duì)發(fā)病機(jī)制究竟是如何作出貢獻(xiàn)。
對(duì)于如何在疾病起源有幾種說(shuō)法。 M.Parkinson可以比作一個(gè)謎。 我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多的作品，并可以把一些他們?cè)谝黄穑覀儾恢朗鞘裁吹娜矘幼印?/span> 我們還沒有制定出一些作品的意義的是，我們也不知道有多少的拼圖碎片，我們?nèi)匀恍枰业街?，我們可以提出M.Parkinson的全貌，并真正了解這種疾病。
我集中在黑質(zhì)多巴胺能個(gè)人腦的神經(jīng)元的基因表達(dá)分析。 這些細(xì)胞選擇性退化，因?yàn)樗鸐.Parkinson病的進(jìn)展。 一旦患者注意到M.Parkinson的主要癥狀，如靜止性震顫是本病的特征，*過70％的多巴胺能神經(jīng)元的SN都已經(jīng)死了。
我的一個(gè)研究的目的是開發(fā)*優(yōu)化的qPCR（定量聚合酶鏈反應(yīng)）為基礎(chǔ)的方法，使有效的從M.Parkinson患者的基因表達(dá)人類驗(yàn)尸組織有前途的候選基因中單個(gè)神經(jīng)元的基因表達(dá)的比較從健康對(duì)照組相同的神經(jīng)元。 我們開發(fā)了一種定量PCR為基礎(chǔ)的平臺(tái)，它可以被用來(lái)分離單個(gè)細(xì)胞的天然組織和獲得高度可比的基因表達(dá)分析。 我們的分析，例如試樣中的RNA的質(zhì)量，表明結(jié)果的質(zhì)量不被染色工藝和激光顯微切割的影響。
實(shí)驗(yàn)過程
圖1：流圖的實(shí)驗(yàn)程序。 流程圖表示的協(xié)議用于UV LMD和定量RT-PCR的基因表達(dá)來(lái)自人死后的大腦PD和對(duì)照個(gè)體的SN多巴胺神經(jīng)元的分析的實(shí)驗(yàn)過程。 發(fā)表于：核酸研究1-16（2008）; DOI：10.1093/nar/gkn084，版權(quán)所有：牛津大學(xué)出版社。
在黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元
不同的驗(yàn)尸樣本的分析都像在 M.Parkinson的特定階段的快照。 我可以相互比較這些快照。 但我不能使用這些樣本來(lái)檢測(cè)一個(gè)改變基因的表達(dá)是否是結(jié)果或疾病的原因。 我們需要做的關(guān)于這個(gè)問題的進(jìn)一步研究。
我檢測(cè)基因表達(dá)的M.Parkinson患者的選擇性多巴胺能神經(jīng)元的策劃改變。 這種變化影響到參與多巴胺代謝的調(diào)節(jié)以及基因離子通道代碼基因。 我們發(fā)現(xiàn)，例如，涉及的合成和提供多巴胺在存活的多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)個(gè)基因的高表達(dá)。 我們還研究了離子通道，調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元的活性不同的基因表達(dá)模式。 在這里，我們注意到，在某些分枝Parkinson病患者的研究基因的表達(dá)的改變。
圖2A：?jiǎn)蝹€(gè)神經(jīng)元的UV-LMD。 （A）左圖：cresylviolet（CV）染色小鼠腦冠狀部分前（左）后（右）紫外激光顯微切割整個(gè)區(qū)域的指示的黑質(zhì)致密部（黑質(zhì)）的區(qū)域。 右側(cè)面板：定性逆轉(zhuǎn)錄（RT）多重巢式PCR產(chǎn)品，適用于整個(gè)LMD黑質(zhì)凝膠電泳結(jié)果。 用于RT-PCR信號(hào)的所有八個(gè)不同的多巴胺能（TH，DAT，GIRK2，D2S / l）和nondopaminergic（GAD，GIRK1，GFAP，CB）的標(biāo)記基因，多巴胺，GABA能和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞混合物中檢測(cè)到。 （DNA梯：100-bp的標(biāo)記）。
圖2B：上：CV-染色紫外lasermicrodissection 15個(gè)人DA能神經(jīng)元后冠狀腦部分。 中：選擇和激光顯微切割從上部的個(gè)人神經(jīng)元。 較低：個(gè)別神經(jīng)節(jié)（左）和上限控制的UV-LMD后（右）展示成功分離。
圖2C：PCR產(chǎn)物的定性多重RT-巢式PCR凝膠電泳個(gè)別LMD SN DA能神經(jīng)元和小SN DA池后。上部和第二屏：多巴胺能標(biāo)記基因（TH，DAT，GIRK2，D2，不GIRK2，GAD67，GFAP）相似的基因表達(dá)模式的20個(gè)游泳池和一個(gè)SN DA能神經(jīng)元的敏感性說(shuō)明協(xié)議和特異性。 第三小組：表達(dá)一個(gè)人鈣結(jié)合蛋白陽(yáng)性CB（+）SN DA神經(jīng)元（D和E）采用cDNA的10％，由15鼠標(biāo)SN DA能神經(jīng)元池為ENO2基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析簡(jiǎn)介模板。 神經(jīng)元的UV-LMD-收集從新鮮或存儲(chǔ)（1周），并重新用于組織切片。
圖 2D：代表實(shí)時(shí)PCR跟蹤測(cè)試ENO2表達(dá)，在對(duì)數(shù)尺度的相對(duì)熒光水平的繪制對(duì)PCR循環(huán)（ΔRN：相對(duì)熒光，歸一化到內(nèi)部的熒光標(biāo)記的ROX）;閾線為閾值的周期確定掃描（CT ）所指出的綠線（ΔRN 0.4）。
圖2E：ENO2檢測(cè)水平（CT）從新鮮和冷凍組織切片（新鮮SN DA細(xì)胞池之間無(wú)顯著差異NS：34.43 + / - 0.51，N = 10;再利用：34.62 + / - 0.48 N = 9 ，P = 0.785）。 發(fā)表于：核酸研究，2008年1-16 DOI：10.1093/nar/gkn084，版權(quán)所有：牛津大學(xué)出版社
激光顯微切割的影響
在過去的幾年中已經(jīng)出現(xiàn)了比較M.Parkinson患者健康組織的黑質(zhì)的完整組織標(biāo)本許多研究。 然而，這種比較是誤導(dǎo)性的，因?yàn)樵谶@些患者中，有70％認(rèn)為有明顯參與了疾病的神經(jīng)元已經(jīng)墮落在其發(fā)病。 此外，所述組合物和被檢查的腦組織切片是非常不均勻的。 所以我們做了到現(xiàn)在為止的“組織”的做法是像梨比較蘋果。
我們希望有選擇地查看所涉及的致病過程，并使用激光顯微切割為在單細(xì)胞水平驗(yàn)證比較中腦多巴胺能神經(jīng)元。 這種技術(shù)使得能夠精確地切割個(gè)別的多巴胺能神經(jīng)元的輸出復(fù)雜的組織，沒有接觸或污染，并分析單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)。 *常見的類型組織中的大腦是支持組織：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是10至50倍，比我們都沒有激光顯微切割感興趣的神經(jīng)元比較常見的，這將是幾乎不可能清晰地刻畫比較少見的神經(jīng)細(xì)胞上的分子水平，他們將無(wú)法從背景噪聲區(qū)別開來(lái)。
單個(gè)細(xì)胞的分析通常會(huì)導(dǎo)致從那些從一個(gè)完整的組織檢查獲得不同的結(jié)果。 研究表明，某些微RNA的表達(dá)在M. Parkinson病患者的組織發(fā)生變化。 我們追蹤這些語(yǔ)句之一，起初我們能夠確認(rèn)的結(jié)果為整個(gè)組織。 但是，我們也同時(shí)在顯微檢測(cè)細(xì)胞。 在這里，我們發(fā)現(xiàn)，微RNA的表達(dá)沒有在單細(xì)胞水平改變。 該組織神器是用激光顯微切割的輔助檢測(cè)。
我們使用激光顯微切割系統(tǒng)，它使單個(gè)細(xì)胞的無(wú)接觸解剖或者，如果需要的話，更大的組織的區(qū)域。 解剖的材料被捕獲在一個(gè)管的蓋子，并且可以立即進(jìn)行處理。
圖3：LMD和人PD個(gè)別SN DA能神經(jīng)元的基因表達(dá)分析和控制死后的大腦。 的neuromelanin陽(yáng)性[NM（+）]的神經(jīng)元（A和B）池是通過從PD（A）cresylviolet染色水平中腦冰凍切片LMD分離和大腦控制（B）。 上圖：從黑質(zhì)NM +神經(jīng)元的小水池LMD后Parkinson?。ˋ）和對(duì)照組（B）冰凍切片。 較低的面板：代表PD（A）和對(duì)照組（B）黑質(zhì)新墨西哥州（+）神經(jīng)元前（左）和解剖后（右）。 插入：UV-LMD后帽控制。 比例尺：250毫米，20毫米，分別為。 （三）分散的a-synuclein基因的表達(dá)，水平PD和控制大腦的情節(jié)。 α-突觸核蛋白基因的表達(dá)15海里（+）和TH（+）黑質(zhì)神經(jīng)元被給定為PG-當(dāng)量從每個(gè)細(xì)胞人類SN-組織（標(biāo)準(zhǔn)曲線定量）由來(lái)的總cDNA的每個(gè)池，通過定量實(shí)時(shí)確定實(shí)時(shí)PCR。 棒表示平均每個(gè)brain_SEM的黑質(zhì)池的a-synuclein的表達(dá)。 （四）情節(jié)的意思的a-synuclein基因水平（_SEM）針對(duì)每個(gè)大腦中的RNA的完整性數(shù)目。 腦銀行代碼表示相鄰的點(diǎn)（參見圖5C和表1）。 （E）之間的線性意味著-突觸核蛋白的表達(dá)和RNA的完整性號(hào)所有個(gè)人分析控制和PD大腦回歸分析顯示無(wú)正相關(guān)關(guān)系組織的高品質(zhì)的RNA之間以及檢測(cè)到-突觸核蛋白的表達(dá)層次（對(duì)照組：黑色虛線，R2 = 0.0506;Parkinson病的大腦：紅色虛線，R2 = 0.9950;所有分析的大腦結(jié)合：黑線，R2 = 0.4369）。 請(qǐng)注意，PD的大腦表現(xiàn)出RNA的完整性之間有很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，并檢測(cè)到-突觸核蛋白的表達(dá)層次（紅色虛線，R2 = 0.9950）。 （六）平均A-SYN，TH和ENO2的表達(dá)水平顯著高于個(gè)人新墨西哥州（+）從SN PD人腦DA能神經(jīng)元與對(duì)照組相比（見表1和表2）。 發(fā)表于：核酸研究1-16（2008）; DOI：10.1093/nar/gkn084，版權(quán)所有：牛津大學(xué)出版社。
在M.Parkinson研究未來(lái)的挑戰(zhàn)
目前，沒有測(cè)試診斷M.Parkinson在早期階段，并且有本病的許多變種，并有類似癥狀的疾病。 因此M.Parkinson案件的一定比例被診斷錯(cuò)誤或不能確診的。
的前提，成功治療 M.Parkinson將是有效的早期診斷。 如果這種疾病可能在哪些神經(jīng)元是剛剛開始?jí)櫬涞某跏茧A段被診斷，有可能防止進(jìn)行性神經(jīng)元變性，使疾病不打出來(lái)的。
在血液或腦脊液生物標(biāo)志物的鑒定是目前的一大研究熱點(diǎn)。 有基因并非只在腦中表達(dá)，但無(wú)所不在 - 在所有細(xì)胞中。 如果這些基因的表達(dá)中的一個(gè)分枝Parkinson情況下，多巴胺能神經(jīng)元被改變，這將是可能的，研究更容易獲得組織診斷的目的。 *個(gè)步驟已經(jīng)采取了，但還有很長(zhǎng)的路要走，這樣的測(cè)試才能實(shí)施，并進(jìn)一步的長(zhǎng)期研究需要進(jìn)行。