一個小區(qū)的許多基本功能強(qiáng)烈依賴于離子的精巧，但盡管如此動態(tài)余額（例如鈣，鎂），電壓電位和細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠之間的pH值和周圍的細(xì)胞外空間。 改變這些余額顯著改變細(xì)胞的行為和功能。 因此，在實(shí)時細(xì)胞內(nèi)離子，電壓和pH動力學(xué)測量是研究人員在神經(jīng)科學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞生理學(xué)一般巨大的興趣。 在很多情況下，然而，實(shí)際的離子濃度，或在一個小區(qū)或蜂窩網(wǎng)絡(luò)的不同位置的相對變化的確切估計(jì)難以用常規(guī)的熒光的方法。 其原因是，這些方法沒有考慮的事實(shí)，即在一個小區(qū)的不同的部件或在蜂窩網(wǎng)絡(luò)中的細(xì)胞類型之間的細(xì)胞形態(tài)的差異可能影響其質(zhì)量和發(fā)射的光的量的帳戶。 這可能導(dǎo)致大量的誤解當(dāng)離子濃度，電壓或pH值的動態(tài)變化進(jìn)行了研究。 比例的成像技術(shù)，通過觀察熒光團(tuán)的發(fā)射波長移位或通過比較熒光團(tuán)組合的發(fā)光強(qiáng)度，而不是單純的測量強(qiáng)度變化繞過這些問題。

離子濃度和pH值或電壓變化的通過測量熒光發(fā)射的變化估計(jì)

研究活動越來越注重識別和時空分布如當(dāng)?shù)氐摹盁狳c(diǎn)”中離子濃度，電壓或pH值在單元格或蜂窩網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)變化。 這樣的“熱點(diǎn)”常常定位于細(xì)胞的專門的部件或在某些細(xì)胞中的蜂窩網(wǎng)絡(luò)中。 此外，相對于試樣中細(xì)胞代謝或結(jié)構(gòu)方面的其余部分，這些區(qū)域通常具有不同的性質(zhì)。 用于研究動態(tài)生理狀態(tài)的常規(guī)熒光在離子結(jié)合，pH值的變化或電壓變化而變化的排放強(qiáng)度（根據(jù)鈣結(jié)合如熒光4增加了排放）。 然而，這些標(biāo)記不考慮到在結(jié)構(gòu)，直徑或標(biāo)記的攝取/表達(dá)的差異可以引起變化的發(fā)射光的那些不與實(shí)際的離子濃度，電壓或pH值的相關(guān)性的量。 定量和同等檢測的變化的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或不同的細(xì)胞，不敏感的方法來構(gòu)造的直徑和熒光團(tuán)濃度是必要的。 而相比之下，非比例成像方法，比率成像提供了機(jī)會，可重復(fù)地測量*細(xì)胞內(nèi)離子，電壓和pH水平/改變相對于細(xì)胞直徑，熒光團(tuán)濃度和成像設(shè)置的光學(xué)性質(zhì)。 但是，比例成像取決于激發(fā)波長或檢測波長，強(qiáng)烈的光源，光學(xué)元件和快速的信號檢測的優(yōu)異的變速器的快速變化。 *快濾光輪，UV光優(yōu)化的物鏡，高度敏感的熒光基團(tuán)和新的CCD相機(jī)的*新發(fā)展使得在高空間分辨率實(shí)惠定量高速活細(xì)胞成像。

雙波長激發(fā)/檢測是關(guān)鍵，用于測量熒光團(tuán)的發(fā)射移

徠卡顯微鏡如上所述，在比率量度攝像的發(fā)光轉(zhuǎn)移僅僅強(qiáng)度變化，而不是被成像。為了測量發(fā)射的變化，熒光團(tuán)或熒光團(tuán)的組合的強(qiáng)度的變化，必須通過使用兩種不同的激發(fā)波長或者通過檢測在兩個不同的發(fā)射波長或者測量。 在通常使用的鈣成像染料FURA-2的情況下，該染料具有被激發(fā)的光在340nm和380nm處，檢測波長的波長為510納米。 相反的是，鈣成像染料吲-1通常是激發(fā)光在350nm的波長和檢測波長為405納米和485納米。

圖1：使用比例鈣指示劑Fura-2從鈣成像實(shí)驗(yàn)的時間推移的快照。 描繪有后340納米（左）和380納米（中）的激發(fā)和相應(yīng)計(jì)算出的比率的圖像（右）假彩色圖像。 所述圖像系列示出了三個個時刻：在時間的*點(diǎn)（1）單元，不刺激，細(xì)胞內(nèi)鈣離子是在靜息水平。 在第二時間點(diǎn)（2）的細(xì)胞受到刺激和鈣是在*大水平。 在時間的第三點(diǎn)（3）的細(xì)胞內(nèi)鈣水平下降。 在該曲線圖在時間上的對應(yīng)點(diǎn)被標(biāo)記。 上部的曲線示出了340nm處的圖像的強(qiáng)度，中間的圖中的380nm處的圖像和下部曲線圖中，顯示了比強(qiáng)度。

但是，為什么需要雙激發(fā)或發(fā)射檢測？ 為什么不能簡單地衡量變化的熒光強(qiáng)度？

定其中的熒光團(tuán)可用于檢測改變離子的水平，電壓或pH一個實(shí)驗(yàn)中，發(fā)射的熒光的光的強(qiáng)度取決于幾個特性。這些將在下面的方程式所描述：

F =熒光強(qiáng)度; C =熒光濃度; D =直徑標(biāo)本（Z軸）; K =光在光通路組件的常數(shù)（單元格屬性，物鏡，過濾器等）; F（x）的介紹，如果如離子綁定或出現(xiàn)電壓/ pH值的變化給定的熒光團(tuán)的發(fā)射行為。

該方程表明，光的強(qiáng)度在很大程度上取決于熒光團(tuán)在光路中的量。 熒光團(tuán)在光路中的量取決于熒光團(tuán)在細(xì)胞和樣品（D）的直徑（通過標(biāo)記的攝取或表達(dá)確定的）（多個）的實(shí)際濃度（c）該被成像。 這使得它很難直接通過簡單地觀察熒光強(qiáng)度，例如，一個不能狀態(tài)估計(jì)一個調(diào)查離子，pH水平或電壓變化的濃度：“100強(qiáng)度等于游離鈣在細(xì)胞中的100nM的”。 試樣直徑（d），熒光團(tuán)的濃度（c）和檢體和設(shè)置（K）的光學(xué)特性幾乎沒有可測量的，但基本上影響整體強(qiáng)度檢測到。 此外，它必須牢記的是，上面示出的公式為真，在檢體任何給定的點(diǎn)。隨著直徑（d）和熒光團(tuán)濃度（C）不是均勻的整個一個試樣，甚至在單個細(xì)胞，對c和d的值可能是在檢體的所獲取的圖像的每一個像素的不同。 如果，例如在點(diǎn)“A”，在樣品中的細(xì)胞的直徑是相當(dāng)高的和游離鈣相當(dāng)?shù)停鈴?qiáng)度可能是同一如在點(diǎn)“B”，它是相對的。 實(shí)驗(yàn)者然而，可能錯誤地得出這樣的結(jié)論中的鈣濃度是在這兩個地方相似，因?yàn)闄z測到的熒光的光強(qiáng)度是類似的。

圖2：草圖上面打算說明如果在小區(qū)內(nèi)如鈣濃度由一個非比例鈣敏感的熒光團(tuán)所發(fā)射的光的強(qiáng)度來判斷可能發(fā)生的錯誤解釋。 草圖下方的曲線代表光強(qiáng)度的感興趣區(qū)域（ROI）中的細(xì)胞的不同部分的區(qū)域。 
在上部圖像（A）中的細(xì)胞在不同的區(qū)室像細(xì)胞突起這往往是精細(xì)結(jié)構(gòu)（如樹突和神經(jīng)元的軸突）不同厚度（四中表現(xiàn)公式）。 作為光路內(nèi)的所有熒光團(tuán)被激發(fā)光激發(fā)而其發(fā)射的光被收集，細(xì)胞的較厚部位出現(xiàn)比薄的部分更亮。 這可能導(dǎo)致的假設(shè)，即在細(xì)胞中的較厚部分中的鈣濃度比可比較薄部分更高，雖然實(shí)際的鈣濃度是相同的。 
在較低的草圖（B）不同的情況被示出。 在某些細(xì)胞類型的熒光團(tuán)占據(jù)的細(xì)胞區(qū)室之間可能會有所不同。 在下部草圖的情況下，鈣濃度（C式中的）中的細(xì)胞的較厚部分較高，但在這方面的熒光團(tuán)濃度較低。 作為鈣敏感染料的檢測到的熒光強(qiáng)度不僅取決于鈣離子濃度在細(xì)胞中，而且還對熒光團(tuán)濃度，人們可能會得到的印象是，在全細(xì)胞中的鈣濃度是相同的。

為了克服這些問題，并為*離子濃度，pH水平或電壓的精確測量，比例成像已經(jīng)被開發(fā)出來。 所有比例的方法的共同之處在于發(fā)射的光的強(qiáng)度被測量兩次且這些強(qiáng)度的比（R）的計(jì)算。 取決于熒光團(tuán)或所用的熒光團(tuán)的組合，所述熒光團(tuán)或者是激發(fā)光的兩個不同波長和發(fā)光強(qiáng)度的測量是在一個波長 - 或熒光團(tuán)或熒光團(tuán)的組合是激發(fā)光1的波長和發(fā)射的測量是在兩種不同波長的光。 這只是意味著兩個灰度值的圖像被獲取和一比圖像從它們算出。 兩個灰度值的圖像通常有不同的強(qiáng)度，但在圖像中的每一個像素的強(qiáng)度可以通過以下所示的公式來描述：(奧林巴斯顯微鏡)

F =熒光強(qiáng)度; C =熒光濃度; D =直徑標(biāo)本（Z軸）; K =光在光通路組件的常數(shù)（單元格屬性，物鏡，過濾器等）; F（x）的介紹，如果如離子綁定或出現(xiàn)電壓/ pH值的變化給定的熒光團(tuán)的發(fā)射行為。

正如其名稱比率成像所暗示的，對于兩個同時獲得的圖像的每一個像素的比率值被計(jì)算。 例如，如果非常常用的鈣敏感染料的Fura-2（激發(fā)在340和380納米）時，所得到的方程是：

根據(jù)簡單的數(shù)學(xué)，C，D和K可以被取消，其比例是可以描述為：

虛擬比例圖像從兩個灰度值圖像計(jì)算

在實(shí)踐中，該比例是由一個計(jì)算機(jī)在一個時間推移實(shí)驗(yàn)計(jì)算，在許多情況下，聯(lián)機(jī)。 通過計(jì)算相應(yīng)的兩個獨(dú)立采集灰度值圖像的像素的灰度值的比率，該比率圖像被創(chuàng)建。 請記住，灰度值的圖像基本上都是灰度值與相機(jī)分辨率的大小或感興趣區(qū)域（ROI）的區(qū)域矩陣（512×512平時，*多不*過1000×1000像素）。 在一個鈣成像時間推移實(shí)驗(yàn)與染料的Fura-2（激發(fā)：340納米和380納米，發(fā)射：510納米）這會工作如下（假設(shè)該圖像具有尺寸3×3個像素）：

圖3：強(qiáng)度讀數(shù)值的簡化插圖CCD照相機(jī)可能使用鈣探針呋喃-2傳遞到計(jì)算機(jī)中的鈣成像實(shí)驗(yàn)這一點(diǎn)。 在這種情況下，圖像將是3×3像素的大小。上部三個矩陣代表在鈣濃度靜止強(qiáng)度讀數(shù)值在340 nm和380 nm激發(fā)加上相應(yīng)的比率值。照片下三個矩陣代表在高亮像素時鈣的升高的強(qiáng)度值的變化。 在340nm處激發(fā)的增加值，而在380nm處激發(fā)減小的值。 但是，相對的比例值也將增加。

執(zhí)行用于每個圖像對中一個時間推移實(shí)驗(yàn)的每個像素這個操作，產(chǎn)生比圖像棧。 *后，以假色圖可以應(yīng)用到比圖像棧和堆然后可以觀看并定量像正常灰度值的時間推移的電影。

除了上面提到的優(yōu)點(diǎn)，一個比率計(jì)算具有附加的優(yōu)點(diǎn)。 在進(jìn)行活細(xì)胞成像與離子，電壓或pH敏感的熒光，熒光強(qiáng)度在相應(yīng)波長的微小變化經(jīng)常發(fā)生。 在比成像，但是，強(qiáng)度的增加，在一個波長和強(qiáng)度降低，在其它波長是在大多數(shù)情況下，觀察到的（不管探針是否被激勵或具有兩個波長檢測）。 如果這兩個獲得的圖像的比率隨后計(jì)算，基線和信號振幅之間的差將相比于熒光團(tuán)的單純的強(qiáng)度變化被增強(qiáng)。 因此，比成像放大檢測到的信號的幅度。 這是用于FRET測定法特別感興趣，在那里的受體蛋白質(zhì)的下降的熒光強(qiáng)度和能量傳輸期間的受體蛋白的增加的熒光強(qiáng)度。