徠卡顯微鏡：熒光顯微鏡發(fā)光的基本原理
有很多自然界中的發(fā)光過(guò)程。發(fā)光是一個(gè)總稱，這些類型的發(fā)光的事件是沒(méi)有結(jié)果的高溫。這篇文章描述了不同形式的發(fā)光和熒光的情況下進(jìn)入細(xì)節(jié)。相關(guān)的技術(shù)術(shù)語(yǔ)描述熒光，就像淬滅，漂白或量子產(chǎn)率，說(shuō)明在第二部分的文章給予詳細(xì)的洞察熒光分子的基本特征
發(fā)光過(guò)程
一些共同的生物學(xué)或生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室方法是基于幾個(gè)“... escences”，如磷光，化學(xué)發(fā)光，生物發(fā)光和最后熒光的存在。熒光蛋白作為一個(gè)引進(jìn)的話題，它可能是非常有用的學(xué)習(xí)多一點(diǎn)“... escences”。這些現(xiàn)象的起源在于拉丁詞見(jiàn)：escentia，這已經(jīng)意味著我們的視覺(jué)系統(tǒng)的連接。所有“... escences”描述，我們可以用我們的眼睛感知的物理，化學(xué)或生物過(guò)程。我們添加后綴“...... escence”詞匯的變化，行動(dòng)或過(guò)程像字療養(yǎng)。
所以，很顯然，熒光的東西，我們可以看到，一些涉及變化或過(guò)程。我們將學(xué)習(xí)如何熒光滿足這些條件后。首先，我們將采取短期看看其他“... escences”，這是所有l(wèi)uminescences本身發(fā)光發(fā)光，這不是一個(gè)高溫的影響是通用的術(shù)語(yǔ)。因此，發(fā)光可以決定作為一個(gè)外表冰冷的身體輻射。這種輻射可以是化學(xué)反應(yīng)或亞原子運(yùn)動(dòng)或在晶體上的應(yīng)力的一個(gè)原因。作為結(jié)果的熱量的物質(zhì)（例如，熱金屬）所發(fā)出的光，以產(chǎn)生發(fā)射的另一種方法是白熱。
化學(xué)發(fā)光的發(fā)光過(guò)程中的化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，該產(chǎn)品具有的激發(fā)中間體。這中間落入地面狀態(tài)時(shí)，發(fā)光。不同于熒光，化學(xué)發(fā)光材料中的電子被激發(fā)，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)，而不是由光子的吸收。化學(xué)發(fā)光認(rèn)定其技術(shù)應(yīng)用在例如熒光棒。一個(gè)眾所周知的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)是魯米諾，它是用來(lái)在刑事找到血液的痕跡。在這里為Fe 2 +離子，它是存在于血紅蛋白作為催化劑的功能，使魯米諾發(fā)光配置。
如果一個(gè)生物體發(fā)光的，我們講的生物發(fā)光，不管如何產(chǎn)生光。有很多生物體產(chǎn)生光，就像螢火蟲(chóng)（夜光Lampyris）或螢火蟲(chóng)（北美產(chǎn)螢火蟲(chóng)）。其他幾種真菌在一排是一個(gè)非常特殊的有機(jī)體的的杰克O'Lantern蘑菇（Omphalotus nidiformis），在黑暗中發(fā)光。大量的海洋生物，如一些珊瑚，藻類，crustacaea，甚至魷魚發(fā)光，大多是在藍(lán)色或綠色的頻譜。海居民Aequorea victoria的水母bioluminating 源的綠色熒光蛋白（GFP）。而螢火蟲(chóng)，例如只使用一個(gè)化學(xué)過(guò)程，產(chǎn)生光，A. 維多利亞使用化學(xué)發(fā)光和熒光過(guò)程。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，水母蛋白水母發(fā)光蛋白的幫助下，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色光。然后，使用該藍(lán)色光激發(fā)綠色發(fā)光熒光反應(yīng)導(dǎo)致已經(jīng)提到的綠色熒光蛋白在。
這使我們的問(wèn)題是：“什么是熒光？” 熒光物質(zhì)發(fā)光波長(zhǎng)較短的光的吸收的效果是一個(gè)過(guò)程。波長(zhǎng)的差異被稱為斯托克的移位。詳細(xì)地說(shuō)，如果發(fā)生熒光的物質(zhì)吸收光的光子的形式。這導(dǎo)致了電子的偏移到更高的能級(jí)。但這種高能量的情況很不穩(wěn)定，這就是為什么電子傾向于返回到基態(tài)。在此過(guò)程中的能量，可以被看作是一個(gè)發(fā)光的光子的形式再次釋放。磷光相比，電子能量轉(zhuǎn)移是非?？斓?，事實(shí)上，在納米秒的范圍內(nèi)（第1圖）。能擁有一種不同的發(fā)光波長(zhǎng)與另一種不同的波長(zhǎng)激發(fā)后的任何物質(zhì)，這是被稱為熒光染料。在下一節(jié)中討論了這些問(wèn)題。最受歡迎的發(fā)熒光的物質(zhì)，存在于自然界中有廣泛的激發(fā)和發(fā)射光譜，但具有明確定義的最大激發(fā)和發(fā)射的物質(zhì)是更加有用的熒光顯微鏡。 類似的熒光，磷光與光激發(fā)磷光材料的發(fā)光的現(xiàn)象。即使它是密切相關(guān)的熒光，它是慢得多。熒光相反減速的再次發(fā)射的光子激發(fā)的電子能量由協(xié)會(huì)與“禁止”狀態(tài)。不會(huì)發(fā)生熒光的情況下盡可能快，因?yàn)樗麄兎祷氐交鶓B(tài)能量被“困”。磷光材料的典型例子是“輝光在這黑暗的”可以“充電”與普通燈泡或日光，然后發(fā)光幾分鐘甚至幾小時(shí)的玩具。 圖 1：熒光雅布隆斯基圖的 如上面已經(jīng)提到，熒光染料是任何能夠發(fā)出熒光的物質(zhì)。在我們的例子中，熒光蛋白是一種熒光染料。在進(jìn)入細(xì)節(jié)之前，我們將介紹一些詞匯及用語(yǔ)描述一種熒光蛋白。一個(gè)字的使用非常頻繁，在與熒光熒光：熒光分子（如蛋白質(zhì)）的那部分，這是負(fù)責(zé)其能力熒光。因此，GFP或其衍生物GFP或其衍生物與任何雜合蛋白的熒光基團(tuán)（例如，α-微管蛋白-GFP）。但是，不具有熒光團(tuán)是一種蛋白質(zhì)。FITC，TRITC（20個(gè)原子）量子點(diǎn)（100-100,000原子）等小分子，如熒光基團(tuán)。 尋找稍微深一點(diǎn)到熒光團(tuán)中，我們到達(dá)的發(fā)色團(tuán)，它是一種分子，它的顏色定義（第2圖）的部分。內(nèi)的發(fā)色基團(tuán)，電子和互連的發(fā)光（見(jiàn)上文）的能量電平轉(zhuǎn)換發(fā)生。有至少兩種形式的發(fā)色基團(tuán)。或者為它們的共軛π電子共振系統(tǒng)（GFP），或金屬配合物（葉綠素，血紅素）構(gòu)建。 由于其相關(guān)的顯微鏡，我們將采取仔細(xì)看看GFP生色。事實(shí)證明GFP的發(fā)色團(tuán)的形成沒(méi)有其他的輔助因子或酶組分比分子氧是必要的。定義的綠色熒光蛋白的氨基酸主鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)，自發(fā)形成中的自催化的折疊機(jī)構(gòu)，并通過(guò)分子內(nèi)重排完成。進(jìn)入的細(xì)節(jié)，發(fā)色基團(tuán)是由三個(gè)相關(guān)的氨基酸Ser65，Tyr66，Gly67依次進(jìn)行的環(huán)化，脫水和氧化。這些反應(yīng)的結(jié)果是一個(gè)共軛的π-電子的諧振系統(tǒng)，成熟的綠色熒光蛋白發(fā)色團(tuán)。 尋找上面的整個(gè)GFP結(jié)構(gòu)，環(huán)狀三肽坐落在中間的氣缸。該筒體是由11股線形成的β-桶結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)高的穩(wěn)定性。β桶結(jié)構(gòu)具有的直徑為3nm左右，高度為約4nm（第3圖）。到目前為止已知的所有的FPS有這樣的保護(hù)筒光物理性質(zhì)上有很大的影響。在綠色熒光蛋白基因的情況下，量子產(chǎn)率和光穩(wěn)定性也比較高。此外，非常緊湊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的高pH電阻。用GFP標(biāo)記的樣品是相對(duì)穩(wěn)健的溫度和高耐受性物質(zhì)，如多聚甲醛，尿素或鹽酸胍變性。 圖 2：層次熒光蛋白 圖3：綠色熒光蛋白（GFP）的分子結(jié)構(gòu) 盡管如此，還是有一定的局限和限制應(yīng)在下一節(jié)中提到的FPS。淬滅的過(guò)程中，例如，熒光團(tuán)的強(qiáng)度，以可逆的方式降低。這種衰變的原因有多種。一方面，有可能是一個(gè)復(fù)合物的形成或一個(gè)內(nèi)部轉(zhuǎn)換。另一方面淬滅可以是能量傳遞過(guò)程的效果。稱為FRET顯微應(yīng)用需要利用這個(gè)程序。在福斯特共振能量轉(zhuǎn)移或熒光共振能量轉(zhuǎn)移到受體熒光A.熒光的D降低，而A增加的熒光，能量轉(zhuǎn)移的供體熒光e。 淬滅是一個(gè)可逆的過(guò)程相反，是一種不可逆的熒光下降過(guò)程被稱為漂白。永久熒光損失是基于長(zhǎng)時(shí)間暴露在激發(fā)光的熒光破壞。漂白的量依賴于光源的強(qiáng)度，照射時(shí)間和能量。每個(gè)熒光漂白劑之前有一定的激發(fā)和發(fā)射周期。在GFP的情況下，每個(gè)分子可興奮約10 4 -10 5倍。符合0.1-1小號(hào)。 使用共聚焦激光掃描顯微鏡的光強(qiáng)度約為10 6 W /米2是常見(jiàn)的。這種高能劑量提供光子過(guò)量導(dǎo)致的現(xiàn)象，很多熒光分子的激發(fā)狀態(tài)。在這種情況下，他們不再在其通常的波長(zhǎng)吸收光。有了它，有效的染料濃度的減少，或者換句話說(shuō)，在顯示器上示出的像素是不再染料濃度的直接函數(shù)。與此相反，以用一個(gè)簡(jiǎn)單的弧燈的照明，可以使用高能量的激光的激發(fā)和發(fā)射之間的一種非線性的關(guān)系。 談到熒光蛋白的效率，我們應(yīng)該提到的量子產(chǎn)率。這是另一種熒光團(tuán)的特征相比，光子的輸入和輸出。對(duì)于某些熒光量子產(chǎn)率計(jì)算，除以發(fā)射光子吸收的 亮度的熒光蛋白是應(yīng)用熒光顯微鏡時(shí)要考慮的另一個(gè)重要特點(diǎn)。根據(jù)顯微鏡的質(zhì)量參數(shù)是在一個(gè)實(shí)驗(yàn)的成功的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。一種客觀的方式來(lái)指定一種熒光蛋白的亮度是其摩爾消光系數(shù)的乘法運(yùn)算，其量子產(chǎn)率除以1,000。摩爾消光系數(shù)的一種物質(zhì)，告訴我們一些關(guān)于其在不同的波長(zhǎng)的光的吸收。詳細(xì)地說(shuō)，摩爾消光系數(shù)是一個(gè)維度中的物質(zhì)的摩爾濃度為1厘米以上的距離在不同的波長(zhǎng)的電磁輻射的吸光度。因此，對(duì)應(yīng)的單位是M -1 cm -1的。 在此計(jì)算中的幫助下，它可以用來(lái)比較的亮度不同的熒光蛋白。如果我們把摩爾消光系數(shù)為5.6萬(wàn)平方米-1厘米-1和量子產(chǎn)率0.6EGFP的例子中，我們得到了一個(gè)價(jià)值33.6 M -1厘米-1。有時(shí)人們談?wù)摰南鄬?duì)亮度的熒光蛋白。在這種情況下的亮度乘以摩爾消光系數(shù)與量子產(chǎn)率和綠色熒光蛋白（33.6 M -1厘米-1）的亮度值除以計(jì)算。通過(guò)這樣做，相對(duì)亮度轉(zhuǎn)換為眾所周知的EGFP的速度稍快，使不同的熒光蛋白的比較 處理大量的熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)觀察活細(xì)胞。以淬滅等特點(diǎn)，并考慮到漂白，生命細(xì)胞成像很明顯，是高度依賴于時(shí)間。即使在組織學(xué)的或固定的細(xì)胞樣品的情況下，重要的是不要太長(zhǎng)的時(shí)間和太多的光強(qiáng)度，照射試樣。描述感興趣的抗蝕劑降低其熒光行為的機(jī)制的熒光蛋白的能力的參數(shù)的耐光性，耐光性被表示為通，直到為初始亮度的50％消失了的秒數(shù)。為了進(jìn)行比較，和最多為10瓦/厘米2的弧光燈提供照明，而高強(qiáng)度的光源，如激光（高達(dá)100瓦/厘米2），可能會(huì)產(chǎn)生的非線性效應(yīng)。此外，測(cè)量和比較的耐光性，熒光蛋白樣品的pH值是標(biāo)準(zhǔn)化，以適于一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的大小的7.0和蛋白質(zhì)溶液的液滴。相鄰的具有上述的光源照明，是連續(xù)的。平行輻射產(chǎn)生的光子進(jìn)行計(jì)數(shù)。EGFP的情況下，需要174秒的原始亮度的一半褪色（沙納等，2005）。換言之，排放量減少至1,000至500光子/秒174秒。 了解不同的特點(diǎn)，如激發(fā)和發(fā)射極大值，亮度，量子產(chǎn)率等有一定的熒光染料或蛋白實(shí)驗(yàn)者能夠選擇不同的候選人或觀測(cè)條件滿足他的要求，具有一定的實(shí)驗(yàn)設(shè)置。此外，他是能夠詳細(xì)地解釋結(jié)果，如果他知道照片的物理特性不同的熒光染料或蛋白質(zhì)。
熒光染料
淬滅和漂白
量子產(chǎn)率
亮度
耐光