直到20世紀(jì)80年代末，大多數(shù)生命科學(xué)的研究生物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的細(xì)節(jié)，捕捉各種使用固定和染色標(biāo)本（實(shí)際上，非生物）的細(xì)胞學(xué)特征的單一快照。然而，在過去的幾十年中，在生物科學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究已經(jīng)在很大程度上轉(zhuǎn)移了重點(diǎn)調(diào)查浩大的時(shí)間尺度上，從幾毫秒到幾小時(shí)不等的生命系統(tǒng)的分子，細(xì)胞和整個(gè)生物體水平上發(fā)生的動(dòng)態(tài)過程。過渡到活細(xì)胞成像的司機(jī)已經(jīng)*的顯微儀器和更敏感的數(shù)碼相機(jī)的發(fā)展，以及新的合成和基因編碼的熒光基團(tuán)，能夠針對(duì)特定的細(xì)胞器，具有精度高。因此，已經(jīng)在很大程度上取得了單桿固定，死細(xì)胞的顯微照片和數(shù)字圖像時(shí)代的活細(xì)胞成像，使用廣泛的合成探針，量子點(diǎn)熒光蛋白，維持細(xì)胞在顯微鏡舞臺(tái)上的焦點(diǎn)長(zhǎng)時(shí)間是一個(gè)關(guān)鍵任務(wù)的因素。

時(shí)間推移活細(xì)胞成像技術(shù)在透射光熒光顯微鏡的應(yīng)用越來越也許是*好的證明了數(shù)量浩繁的研究報(bào)告，幾乎每天在科學(xué)文獻(xiàn)中出現(xiàn)。在大多數(shù)情況下，細(xì)胞活性監(jiān)測(cè)在組織培養(yǎng)中的成像腔室專門設(shè)計(jì)的顯微鏡載物臺(tái)，使用熒光探針耦合到順序的圖像捕獲技術(shù)。可以采用廣泛的在長(zhǎng)的時(shí)間期間內(nèi)的標(biāo)本作為連續(xù)序列的用于記錄的動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)的高級(jí)技術(shù)，如微分干涉相差（DIC），相襯，暗場(chǎng)，熒光，和Hoffman調(diào)制反差（HMC）。同樣，更*的熒光技術(shù)，包括激光掃描共聚焦，旋轉(zhuǎn)盤，多光子，和全內(nèi)反射顯微鏡（TIRF）越來越多地被用來監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)過程，隨著時(shí)間的推移。

除了 其在細(xì)胞生物學(xué)中的重要性，時(shí)間推移成像也可以用來研究廣泛的液體樣品和固體材料在化學(xué)，工業(yè)，和地質(zhì)系統(tǒng)，以及液晶的相變和結(jié)構(gòu)分析的新的和*金相材料。時(shí)間推移成像（也稱為cinemicrography）在基本的生命科學(xué)領(lǐng)域，已被證明是一種有效的工具，調(diào)查粒子的運(yùn)動(dòng)，分子間的相互作用，細(xì)胞遷移，細(xì)胞分裂，細(xì)胞器動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞凋亡，分化，神經(jīng)過程的產(chǎn)物，而其中新的和有前途的應(yīng)用程序的主機(jī)。*近，發(fā)展跨越整個(gè)可見光譜的熒光蛋白的**已經(jīng)導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)無數(shù)的動(dòng)態(tài)細(xì)胞內(nèi)事件隨著時(shí)間的推移，只能通過觀察調(diào)查。

圖1給出的是從一些更加有用和流行的時(shí)間推移成像對(duì)比增強(qiáng)技術(shù)，在活細(xì)胞顯微鏡的例子。粘附印度麂鹿皮膚成纖維細(xì)胞在圖1（a）所示，在DIC模式成像，可視化應(yīng)力纖維細(xì)胞骨架的產(chǎn)物。相襯成像袋鼠大鼠腎上皮細(xì)胞（PtK1線）圖1（b）中揭示了一個(gè)雙核細(xì)胞產(chǎn)生的中止細(xì)胞分裂，而個(gè)別人成骨肉瘤（U2OS線）細(xì)胞被捕獲成功的分工與HMC圖1（c）。這些功能**的透射光技術(shù)被廣泛利用時(shí)間推移活細(xì)胞成像。同樣，激光掃描熒光技術(shù)和旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡（圖1（d）中DEOS熒光蛋白在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中，和圖1（e）中，EGFP-標(biāo)記在HeLa細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）可以采用數(shù)的觀測(cè)，包括光活化，共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），光漂白技術(shù)，運(yùn)動(dòng)性，熒光蛋白分布的動(dòng)態(tài)。全內(nèi)反射熒光顯微鏡（全內(nèi)反射螢光顯微鏡，圖2（f），示出mCherry融合到紐蛋白狐肺成纖維細(xì)胞中的熒光蛋白）的事件發(fā)生在細(xì)胞膜附近的蓋玻片。

時(shí)間推移成像的歷史透視

報(bào)道時(shí)間推移成像在活細(xì)胞中的首次應(yīng)用在100多年前（大約五年之前，查理·卓別林他的*部電影），由一位年輕的法國(guó)研究生在梅毒螺旋體檢查蠕動(dòng)。學(xué)生，讓Comandon耦合到一個(gè)更小的暗視野顯微鏡，一個(gè)復(fù)雜的配置期間使用一個(gè)巨大的電影膠片相機(jī)拍攝的圖像序列，但認(rèn)為很簡(jiǎn)陋，按現(xiàn)代標(biāo)準(zhǔn)。在二十世紀(jì)后半期，通常采用緊湊型16毫米相機(jī)配備相襯照明顯微鏡時(shí)間推移圖像序列的。由笨重的輔助intervalometers的，，可將燈泡的裝置，打開和關(guān)閉，以避免過度的照明和加熱的標(biāo)本的圖像之間的連續(xù)的圖像捕獲之間的時(shí)間間隔的控制。光源電子顯微鏡百葉窗市售直到20世紀(jì)80年代。

早期時(shí)間推移依靠膠片相機(jī)的成像技術(shù)受到一些陷阱。*重要的是，這部電影被發(fā)送出去（在大多數(shù)情況下），商業(yè)處理，這意味著可能會(huì)延遲幾天甚至幾周，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)。此外，膜的使用是昂貴的，并可能會(huì)到一個(gè)主機(jī)的處理變化，通常導(dǎo)致不一致的結(jié)果。例如，暴露的錯(cuò)誤可能不會(huì)被發(fā)現(xiàn)，直到幾個(gè)星期后，實(shí)驗(yàn)已得出結(jié)論，焦點(diǎn)漂移的常見的問題往往是不可檢測(cè)的，直到處理過的膜被看過。雖然很多時(shí)間推移成像，如焦點(diǎn)漂移，試樣加熱不均勻和振動(dòng)相關(guān)的文物，仍然妨礙用現(xiàn)代數(shù)碼相機(jī)的*終結(jié)果時(shí)，該技術(shù)已在過去十年顯著成熟。

視頻管攝像機(jī)和圖像采集卡的電腦卡時(shí)發(fā)生的*次重大進(jìn)步時(shí)間推移cinemicrography中終于整合與顯微鏡，在20世紀(jì)70年代開始。雖然由視頻攝像機(jī)產(chǎn)生的圖像是較低的分辨率比傳統(tǒng)的基于乳液的膜，與膠片相機(jī)的曝光設(shè)置的不確定性顯著降低。作為一個(gè)額外的好處，對(duì)圖像序列可以被視為在收購(gòu)過程中，和一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是立即可用的審查和編輯使用的錄像帶輸出。相比較而言，耦合到一個(gè)錄音機(jī)攝像機(jī)的成本顯著小于膠片處理的費(fèi)用被認(rèn)為是一個(gè)電影時(shí)的電影攝影機(jī)。相對(duì)于膜的錄像帶的復(fù)制成本也少得多，磁帶含有不良序列可以被擦除或覆蓋放回生產(chǎn)。

活細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的一個(gè)例子是圖2中使用photoconvertible 光學(xué)熒光筆熒光蛋白標(biāo)記的線粒體。標(biāo)本是一個(gè)堅(jiān)持的兔腎上皮細(xì)胞培養(yǎng)（RK-13 線）紅-的綠色photoconvertable DEOS到線粒體靶向肽序列的熒光蛋白融合表達(dá)。用488納米的激光照射后，豐富的線粒體，整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中觀察到（圖2（a））的綠色熒光。一個(gè)單一的線粒體位于長(zhǎng)filopodium在是使用一個(gè)簡(jiǎn)短的脈沖光轉(zhuǎn)換，從405納米激光在*幀。新紅色熒光的細(xì)胞器被捕獲后，未轉(zhuǎn)換的線粒體途徑（圖2（b））的時(shí)間間隔為20分鐘。粉碎后，使未轉(zhuǎn)化的線粒體密切的光轉(zhuǎn)換鄰居（圖2（c）），兩個(gè)線粒體其后的保險(xiǎn)絲（圖圖2（d））的光轉(zhuǎn)換的熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞器之間的分布的方法。的第二碎片事件后（圖2條（e）），一小部分的光轉(zhuǎn)換線粒體接近的第二未轉(zhuǎn)化的線粒體，但，而不是定影，形成一個(gè)環(huán)形（圖2（f））。在圖2所示的幀選擇從時(shí)間推移序列含有*過1000個(gè)在2小時(shí)內(nèi)收集的圖像。

雖然越來越多的研究者開始參與時(shí)間推移活細(xì)胞利用熒光蛋白質(zhì)序列采集，數(shù)字靜止圖像記錄長(zhǎng)時(shí)間在細(xì)胞培養(yǎng)的動(dòng)態(tài)事件繼續(xù)被廣泛采用。在許多情況下，間歇性的單一的圖像可以被捕獲，具有改進(jìn)的信號(hào)與噪聲的使用更大的照度水平比是可行的串行時(shí)間推移成像在更高的分辨率。然而，技術(shù)的迅速發(fā)展，計(jì)算機(jī)體系結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)能力，推動(dòng)時(shí)間推移cinemicrography到一個(gè)新的水平。上一頁主存儲(chǔ)器中的局限性，已克服了快速緩存，處理器速度和硬盤驅(qū)動(dòng)器的能力，使復(fù)雜的含有數(shù)千幀的圖像序列，組成幾個(gè)GB，可以存儲(chǔ)在本地的主機(jī)計(jì)算機(jī)上。硬件的進(jìn)步已經(jīng)由新的和復(fù)雜的軟件套件能夠控制幾乎所有方面，包括高速圖像采集階段，運(yùn)動(dòng)，光照強(qiáng)度，曝光時(shí)間（和其他的相機(jī)參數(shù)），輔助的光學(xué)元件（如DIC棱鏡平行光路）和波長(zhǎng)。**的軟件也可以進(jìn)行收購(gòu)后的圖像處理，增強(qiáng)的視頻功能。在簡(jiǎn)單的系統(tǒng)中，中等性能的計(jì)算機(jī)可通過一些接口來控制科學(xué)級(jí)數(shù)碼相機(jī)。

現(xiàn)代的專門的熒光顯微技術(shù)，包括激光掃描共聚焦，旋轉(zhuǎn)盤，全內(nèi)反射熒光，和多光子耦合到新興電子倍增電荷耦合器件（EMCCD）技術(shù)的進(jìn)步，已使科學(xué)家能夠觀察到了廣泛的動(dòng)態(tài)事件，利用新開發(fā)的熒光針對(duì)特定的細(xì)胞區(qū)室，生物分子和受體蛋白的探針。通過采用這種*的方法，多個(gè)事件可同時(shí)被記錄，可在四個(gè)或更多的尺寸（橫向，軸向，時(shí)間和光譜）在一個(gè)選定的時(shí)間內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的活性，提供一種非侵入性的窗口。此外，活細(xì)胞成像技術(shù)已經(jīng)導(dǎo)致了當(dāng)前的**，這是科學(xué)家提供空間和時(shí)間的信息是以前無法在細(xì)胞生物學(xué)。

焦點(diǎn)漂移的起源

盡管各種各樣的技術(shù)進(jìn)步，在過去幾年發(fā)生在光學(xué)顯微鏡，標(biāo)本對(duì)焦緩慢變化的過程中，時(shí)間推移成像表現(xiàn)軸向波動(dòng)仍然是一個(gè)重大的問題。焦點(diǎn)漂移的術(shù)語經(jīng)常被用來描述的顯微鏡不能保持在一個(gè)延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)選定的焦平面。此構(gòu)件是獨(dú)立發(fā)生的自然運(yùn)動(dòng)的活標(biāo)本，主要影響的因素，下面列出了一些。在一般情況下，重點(diǎn)漂移更是一個(gè)問題，當(dāng)使用高倍率和數(shù)值孔徑的油浸目標(biāo)（有一個(gè)非常淺的景深），比它低倍率（10倍和20倍）具有更廣泛的震源深度的目標(biāo)。

• 熱漂移 -焦點(diǎn)漂移溫度變化也許是*常見的來源。作為一個(gè)結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)室中的空調(diào)和中央加熱單元，在顯微鏡上的強(qiáng)烈的照明光源，以及受熱不均目標(biāo)和階段產(chǎn)生的溫度波動(dòng)通常是主要的焦點(diǎn)漂移的罪魁禍?zhǔn)住?/span>此外，差的膨脹和收縮率的材料用于構(gòu)造培養(yǎng)室和/或顯微鏡光學(xué)列車可能會(huì)導(dǎo)致物鏡前透鏡與蓋玻片之間的距離的變化，導(dǎo)致失焦。具有*高的倍率物鏡，只是一個(gè)度的變化往往足以產(chǎn)生在焦平面上的偏移在0.5和1.0微米之間。

• 蓋玻片的Flex -熱梯度和其他變化，在培養(yǎng)室的溫度，以及與迫使流體通過灌注過程中的攝像室的工件，可以制作試樣反彈的重點(diǎn)蓋玻片彎曲膜片效果。此神器往往是明顯的在灌注系統(tǒng)控制不佳室。蓋玻片彎曲可能不存在重大問題灌注會(huì)話之間可以是交錯(cuò)的情況下，圖像采集序列，但它會(huì)嚴(yán)重影響這些研究需要相對(duì)較高的時(shí)間分辨率（2秒或更少）。蓋玻片的彎曲可以通過減少灌注輸入端口的直徑在流室，和裝備在顯微鏡用客觀的加熱器，補(bǔ)償室溫度波動(dòng)*小化。蓋玻片小，但重現(xiàn)性好，運(yùn)動(dòng)也可能發(fā)生在文化室配備，透明導(dǎo)電涂層，以維持溫度。在這種情況下，施加電流負(fù)載的涂布蓋玻片可以產(chǎn)生收縮或擴(kuò)展暫時(shí)打亂焦點(diǎn)。正確的焦平面通常會(huì)被重新建立，一旦電流負(fù)載被刪除。

• 成像室加熱不均勻性 -活細(xì)胞成像腔中產(chǎn)生各種各樣的配置，通常使用完全不同的技術(shù)，保持在恒定溫度下的試樣。例如，設(shè)有加熱用導(dǎo)電涂層的蓋玻片（圖3（a））的腔室通常在整個(gè)玻璃表面產(chǎn)生***的熱一致性比腔室，熱只蓋玻片的周邊周圍的金屬。在后一種情況可能是巨大的熱梯度（圖3（b））。此外，高數(shù)值孔徑的油或水的浸入目標(biāo)可以作為一個(gè)接收器進(jìn)行從試樣腔室并進(jìn)入金屬目標(biāo)的熱量帶走，這樣就產(chǎn)生了在該區(qū)域的液浸介質(zhì)的熱梯度。其他文物，如電流從電源和室溫大幅波動(dòng)變化也可以負(fù)責(zé)標(biāo)本室加熱違規(guī)。



• 振動(dòng) - 與眾多的起源-一種常見的神器，振動(dòng)往往會(huì)產(chǎn)生各種器樂配置相關(guān)的元素，除了在周圍環(huán)境產(chǎn)生的來源。在顯微鏡和配件，過濾器車輪，百葉窗，自動(dòng)階段，過濾器的炮塔，和其他機(jī)電運(yùn)動(dòng)部件，是一種常見的振動(dòng)源，干擾穩(wěn)定的聚焦。常見的外部（非顯微鏡）振動(dòng)源是空氣處理系統(tǒng)，客流量，冰箱壓縮機(jī)，電梯，重型設(shè)備附近的成像設(shè)置的議案。隔離表，減震墊，臺(tái)式平臺(tái)，從各種各樣的分銷商的使用，是有用的，以減少振動(dòng)。

• 機(jī)械不穩(wěn)定性 -滿載目標(biāo)的物鏡轉(zhuǎn)換器3和5磅重，這往往代表了顯著的引力涉及顯微鏡對(duì)焦機(jī)構(gòu)的機(jī)械部件上的應(yīng)變。因此，重點(diǎn)漂移可能發(fā)生，只是由于物鏡轉(zhuǎn)換器上的引力。此神器可以只使用一個(gè)單一的目標(biāo)，記錄的時(shí)間推移錄像，在一定程度上緩解。此外，它是明智的，以確保（如果可能），配備有具有短的機(jī)械長(zhǎng)度的精密聚焦系統(tǒng)的顯微鏡，聚焦張力控制以維持適當(dāng)?shù)脑O(shè)置。機(jī)械不穩(wěn)定性的其它來源包括松散的齒輪組，在焦點(diǎn)機(jī)架或冷凝器的支柱，以及輔助元件。

• 沉浸媒體波動(dòng) -在高分辨率活細(xì)胞調(diào)查的時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)，在顯微鏡目標(biāo)可能需要浸泡介質(zhì)油，水，甘油組成。需要收集到足夠的數(shù)據(jù)，粘度波動(dòng)和化學(xué)分解的成像介質(zhì)在長(zhǎng)時(shí)間浸沒介質(zhì)的屬性和傳播的影響。浸沒油的粘度和折射率也常常依賴于溫度和水容易蒸發(fā)，是必須考慮的因素和監(jiān)視，以避免焦點(diǎn)漂移。新開發(fā)的高性能有機(jī)精油可在廣泛的折射率（包括水和甘油是相同的值），并提供*的解決方案，采用傳統(tǒng)浸泡媒體。在某些情況下（取決于成像室配置），墊圈或管道可以利用形成的目標(biāo)和蓋玻片之間的密封，以減少水蒸發(fā)的水平。

• 添加試劑 -許多調(diào)查需要改變培養(yǎng)基或添加化學(xué)試劑時(shí)間推移成像序列的。引入到培養(yǎng)室中的試劑的實(shí)際行為，可以產(chǎn)生機(jī)械沖擊，這將導(dǎo)致在焦點(diǎn)漂移，加入試劑，不作為成像介質(zhì)在相同溫度下，可以產(chǎn)生類似的效果。在加熱灌注系統(tǒng)中，引進(jìn)的新的媒體或化學(xué)品產(chǎn)生的軸向聚焦平面的顯著的改變，但加入一個(gè)開放的腔室，使用移液管或注射器的液體，可以擾亂焦點(diǎn)。

• 側(cè)向階段呈 -在某些情況下，房間內(nèi)的溫度波動(dòng)或振動(dòng)會(huì)產(chǎn)生一個(gè)小的橫向（ - Y）翻譯的機(jī)械載物臺(tái)，（在某些情況下）會(huì)導(dǎo)致軸向聚焦漂移。這通常是一個(gè)微不足道的問題，但可以成為嚴(yán)重的，如果一個(gè)開放的管道推動(dòng)直接在顯微鏡上的冷或熱空氣。如果階段都配有一個(gè)夾子，它應(yīng)該被啟動(dòng)，開始時(shí)間推移成像之前，但除此之外，也有一些補(bǔ)救措施。*的顯微鏡階段，采用步進(jìn)電機(jī)一般不影響由橫向移動(dòng)文物。

• 不安全標(biāo)本室 -試樣成像室運(yùn)動(dòng)在時(shí)間推移順序可能會(huì)導(dǎo)致焦點(diǎn)漂移由于蓋玻片到新的位置。適配器固定玻璃底培養(yǎng)皿舞臺(tái)光圈在第二階段，在盤位置的變化可能發(fā)生的結(jié)果柔性鉗或干擾電線和氣體/液體腔油管連接控制器和其他機(jī)械制品，如輔助元件。此外，經(jīng)常遭受多井成像室時(shí)從輕微安置變化連接到單獨(dú)的蓋玻片每口井，導(dǎo)致聚焦誤差，同時(shí)掃描板。商會(huì)的運(yùn)動(dòng)和蓋玻片高度不一致是一種常見的定期神器，必須加以解決。

• 標(biāo)本運(yùn)動(dòng) -活細(xì)胞成像的一個(gè)不可避免的神器是遠(yuǎn)離的標(biāo)本在顯微鏡焦平面的運(yùn)動(dòng)。這通常發(fā)生在收集貼壁細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，細(xì)胞顯著改變形狀，在中期時(shí)間推移序列。在其他情況下，試樣完全可以移動(dòng)的視場(chǎng)，可以通過分離蓋玻片或通過蠕動(dòng)。除了 使用凝膠和試劑，如纖連蛋白，錨定的細(xì)胞和組織的蓋玻片，有沒有機(jī)械，化學(xué)或電氣補(bǔ)救辦法試樣移動(dòng)。

焦點(diǎn)漂移的解決方案

多年來，糾正焦點(diǎn)漂移的*佳解決方案是到車站學(xué)生或技術(shù)人員在顯微鏡附近，以提供手動(dòng)重新聚焦在必要時(shí)。不幸的是，這是一個(gè)相對(duì)成本太高，基本上是無效的解決方案，那肯定是不適合長(zhǎng)期的成像實(shí)驗(yàn)。通過多種途徑，包括軟件算法，硬件專用的顯微鏡，防震襯墊和表，并包圍在一個(gè)保護(hù)環(huán)境（如在圖4中示出），在顯微鏡焦點(diǎn)漂移的問題已得到解決。在這些方法中，得到不同程度的成功，但都沒有提供一種通用的解決方案，可以擴(kuò)展到幾乎任何活細(xì)胞成像場(chǎng)景的焦點(diǎn)漂移。

對(duì)熱不穩(wěn)定，這也許是*重要的焦點(diǎn)漂移源，可以在很大程度上消除了大的有機(jī)玻璃外殼（被稱為環(huán)境試驗(yàn)箱 ;圖4（C））絕緣顯微鏡，從外部環(huán)境，也提供了良好的條件，促進(jìn)日志期的細(xì)胞生長(zhǎng)。的保育箱式的外殼包圍，幾乎涵蓋整個(gè)顯微鏡和標(biāo)本的顯微鏡載物臺(tái)，目標(biāo)，熒光過濾器，和傳輸?shù)墓饩€的聚光。這些房間可以使用與多種文化的容器，包括標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿，安裝蓋玻片顯微鏡載玻片和各種各樣的開放式和封閉式的成像室。與外部加熱單元（通常強(qiáng)制空氣）和二氧化碳的濃度來控制的感測(cè)單元，其耦合到一個(gè)穩(wěn)壓器，它的輸入由純氣體的氣缸的溫度被保持。

環(huán)境室配有濕度控制等多種設(shè)計(jì)方案也可以提供橡膠手套訪問操縱細(xì)胞時(shí)，在成像過程中對(duì)環(huán)境的平衡，以避免干擾。為了維持高度的溫度控制，以避免焦點(diǎn)漂移，一些更復(fù)雜的孵化室括幾乎整個(gè)顯微鏡目鏡，攝像頭，lamphouses異常。在下行路上，環(huán)境試驗(yàn)箱可以阻礙快速訪問標(biāo)本和繁瑣的重復(fù)操作時(shí)是必要的。此外，腔室內(nèi)部的高濕度水平可加至維持齒輪潤(rùn)滑油過早降解和氧化的金屬表面和透鏡涂料由于儀器費(fèi)用。作為替代方案，耦合階段的*佳孵化器的目標(biāo)加熱器可以使用，但這些設(shè)備并不總是具有難以去除的保護(hù)桶浸入目標(biāo)兼容。

在過去的幾十年中已經(jīng)制訂了一些軟件算法，以解決基于對(duì)比度或邊緣檢測(cè)的焦點(diǎn)漂移。許多這些*終被納入科學(xué)的設(shè)計(jì)也處理圖像和控制顯微鏡的成像軟件包。軟件控制的焦點(diǎn)漂移需要在顯微鏡配備了一臺(tái)數(shù)碼相機(jī)和電動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器在計(jì)算機(jī)控制下。通常情況下，重點(diǎn)調(diào)查的基于軟件的顯微鏡需要兩個(gè)互補(bǔ)的算法來實(shí)現(xiàn)聚焦控制。首先建立一個(gè)客觀真實(shí)的焦點(diǎn)的軸向（z）的位置之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。第二個(gè)是一個(gè)搜索算法（圖5），樣品的焦平面，所捕獲的圖像，以確定*大聚焦“分?jǐn)?shù)”（*佳位置）的位置。然而，大多數(shù)軟件控制重點(diǎn)開發(fā)的算法，已建立使用靜態(tài)的標(biāo)本具有穩(wěn)定的幾何和動(dòng)態(tài)活細(xì)胞時(shí)間推移調(diào)查時(shí)，適用于遠(yuǎn)低于有效。此外，該算法通常是優(yōu)化的一個(gè)特定的照明情況下（明場(chǎng)，相襯，等），可能會(huì)失敗時(shí)，適用于對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)（如熒光），它們并沒有設(shè)計(jì)。

軟件聚焦算法一般依賴于一個(gè)事實(shí)，即良好的聚焦圖像中含有較多的對(duì)比度或重點(diǎn)比圖像更精細(xì)的細(xì)節(jié)（實(shí)際上，更高的頻率）。作為一個(gè)例子，使用拉普拉斯算子來估計(jì)焦點(diǎn)時(shí)，該算法計(jì)算圖像樣本的二階空間導(dǎo)數(shù)，向上或向下移動(dòng)的目標(biāo)由一個(gè)預(yù)先確定的量，然后重復(fù)該過程，直到確定*適合。越來越小的步驟通常是在兩個(gè)方向上，在分析過程中。從過濾器的輸出值表示大的強(qiáng)度的變化，這通常表示一個(gè)圖像內(nèi)的邊緣區(qū)域。在任何圖像，*高的頻率成分發(fā)生在邊緣，當(dāng)試樣是優(yōu)化的重點(diǎn)，應(yīng)該是*突出的特點(diǎn)。為重點(diǎn)的漂移，邊緣模糊，在圖像上產(chǎn)生較低的二階導(dǎo)數(shù)。直到確定*合適的重復(fù)采樣。這通常需要幾分鐘的時(shí)間，只有那些時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)需要使用較長(zhǎng)的時(shí)間間隔拍攝圖像之間的降級(jí)軟件重點(diǎn)例程。

在共聚焦時(shí)間推移顯微鏡，每一個(gè)形象仍然是大家關(guān)注的焦點(diǎn)，無論儀器是否遇到軸向漂移，對(duì)焦校正可以通過定期收集了一系列從標(biāo)本z棧的（光學(xué)部分）的厚度，不論。各個(gè)堆進(jìn)行分析，然后使用軟件來確定?堆棧中的每個(gè)圖像的參考圖像的記錄，可在該序列的開頭之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。堆疊分析后，具有*大相關(guān)系數(shù)的圖像的像素強(qiáng)度是用來識(shí)別正確的焦平面（對(duì)應(yīng)的參考圖像的平面）。共定位信息可以被用于重置的焦平面上的目標(biāo)。雖然這種技術(shù)應(yīng)該工作得非常好，提供的軟件和硬件正確連接，目前還沒有商業(yè)應(yīng)用。

從理論上講，熒光標(biāo)本應(yīng)使用軟件算法產(chǎn)生極好的效果，由于之間有極高對(duì)比度的明亮的熒光結(jié)構(gòu)和黑暗的背景。然而，在實(shí)踐中，基于軟件的補(bǔ)償技術(shù)需要基于捕獲圖像的幾種熒光物種，這可能會(huì)導(dǎo)致光漂白和光毒性加重每次曝光時(shí)與試樣光的效果的計(jì)算。此外，該算法確定重點(diǎn)用清脆的生產(chǎn)工具集中的軸向焦點(diǎn)位置（如共聚焦，多光子，DIC）光學(xué)部分，無論實(shí)際上是無用的。使用軟件時(shí)，保持焦點(diǎn)另一個(gè)缺陷是，該算法往往能決定一個(gè)*佳的，不同的是開始時(shí)選擇的時(shí)間推移序列從初始平面的焦平面。當(dāng)使用組合的熒光與軟件確定聚焦算法，另一種方法是用試樣的透射光圖像進(jìn)行聚焦分析步驟。然而，這需要應(yīng)用機(jī)械快門的熒光和透射的光路中，可引入額外的振動(dòng)。

圖6中所示的兩個(gè)時(shí)間推移進(jìn)行沒有任何焦點(diǎn)漂移校正（圖6（a），圖6（b）和圖6（c）），或基于硬件的焦點(diǎn)維護(hù)系統(tǒng)的，如下面所討論的序列（圖6（2），6（e）和（f）條）。樣品是狐肺癌（FoLu線）成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，表達(dá)的mPlum熒光蛋白的融合產(chǎn)生的明亮的熒光的細(xì)胞器線粒體靶序列。圖像聚集在的組合熒光和DIC模式在30秒的時(shí)間間隔*過7小時(shí)內(nèi)共聚焦顯微鏡操作。如果沒有自動(dòng)對(duì)焦系統(tǒng)，在顯微鏡迅速失去焦點(diǎn)，證明熒光強(qiáng)度在圖6（b）和圖6（c），其中發(fā)生在不到45分鐘內(nèi)連續(xù)虧損。相比之下，硬件自動(dòng)對(duì)焦管理產(chǎn)生銳利，整個(gè)調(diào)查的良好聚焦圖像（圖6（四）通過圖6（f）條）。

焦點(diǎn)漂移補(bǔ)償系統(tǒng)

多年來，已開發(fā)了一些基于硬件的解決方案，以補(bǔ)償焦點(diǎn)漂移。在大多數(shù)情況下，這些設(shè)備試圖測(cè)量的目標(biāo)和試樣夾持器或階段之間的距離，以保持試樣在很長(zhǎng)一段時(shí)間的焦點(diǎn)。例如，渦電流傳感器連接到顯微鏡的物鏡轉(zhuǎn)換器的設(shè)計(jì)是由一個(gè)發(fā)明者監(jiān)視的距離的階段，使用的直流電動(dòng)機(jī)耦合到聚焦機(jī)構(gòu)的正確的波動(dòng)。另一種技術(shù)利用的試樣夾持器和領(lǐng)子連接的目標(biāo)，以提供支撐的試樣夾持器的壓電元件的誤差信號(hào)之間的距離相關(guān)的電容。第三，更復(fù)雜的方法依賴，全息光柵放置在客觀瞳孔保持標(biāo)本的焦點(diǎn)。專門的光柵產(chǎn)生兩個(gè)散焦的*，被檢測(cè)到的圖像由單獨(dú)的傳感器來產(chǎn)生聚焦校正信號(hào)。*后，納入到現(xiàn)代的硬件解決方案的前體使用兩個(gè)光電二極管陣列的離軸的氦 - 氖激光束被定向到一個(gè)小的棱鏡放置在光學(xué)列車和監(jiān)測(cè)的背面反射的焦點(diǎn)依賴性變化。自******移的焦點(diǎn)被檢測(cè)為一個(gè)非零的差信號(hào)，然后將其用于驅(qū)動(dòng)一個(gè)簡(jiǎn)單的電機(jī)連接到細(xì)焦點(diǎn)的機(jī)制。雖然這些硬件焦點(diǎn)補(bǔ)償方案在不同程度上取得了成功，都沒有看到值班商業(yè)顯微鏡系統(tǒng)。

作為一個(gè)通用的方法來提高顯微鏡聚焦穩(wěn)定性，制造商已經(jīng)花費(fèi)了相當(dāng)大的努力來生成工程改進(jìn)焦點(diǎn)漂移降低到*低限度。例如，一些嵌入式的機(jī)械系統(tǒng)（對(duì)焦組件，百葉窗，電動(dòng)平臺(tái)，炮塔旋轉(zhuǎn)）的改善，重目標(biāo)的問題得到解決。儀器幀正在制作專門合金的是耐熱膨脹的，而輔助元件如物鏡轉(zhuǎn)換器正在與耐熱聚合物。這種改進(jìn)已經(jīng)加上*的線性編碼器，機(jī)動(dòng)階段或物鏡轉(zhuǎn)換器組件，可以搬遷到一個(gè)精確的位置精度優(yōu)于50納米。即使這些改進(jìn)導(dǎo)致了*的顯微鏡，可以保持注意力集中于一兩微米或更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，它們?nèi)匀粺o法克服的事實(shí)，加熱試樣室（以及它們的相關(guān)聯(lián)的蓋玻片）熱膨脹和收縮，導(dǎo)致備份到原來的焦點(diǎn)漂移問題。

為了解決熱漂移文物固有的幾乎所有基于蓋玻片成像室，顯微鏡和廠家售后*近推出新的硬件解決方案，以彌補(bǔ)焦點(diǎn)漂移雇用幾個(gè)有所不同，但仍密切相關(guān)的方法。一個(gè)重要的一點(diǎn)要注意的是，與浸沒目標(biāo)，其中的大部分設(shè)備基礎(chǔ)上進(jìn)行操作的假設(shè)下觀察試樣，并在蓋玻片的水性表面之間的關(guān)系是固定的（因此，細(xì)胞或薄的組織是不自由浮動(dòng)在培養(yǎng)液中）。相反，無論是自然粘附在玻璃上的細(xì)胞或組織（例如果蠅卵室）或通過，層粘連蛋白，纖連蛋白，多聚賴氨酸，或糖蛋白的薄層連接到蓋玻片。所有的市售系統(tǒng)定位上的外部蓋玻片表面（玻璃及組織培養(yǎng)基或緩沖液之間的界面），通過測(cè)量弱的近紅外線激光或發(fā)光二極管（LED所發(fā)出的反射光的位置的形狀的線圖案;圖7中所示）。相反，對(duì)于干燥的目標(biāo)，從蓋玻片的下表面（與空氣接觸）的光反射是用來確定試樣是否是關(guān)注的焦點(diǎn)。

插圖圖7圖焦點(diǎn)漂移補(bǔ)償系統(tǒng)如何能夠利用從蓋玻片衡量相對(duì)焦點(diǎn)位置的光的反射。試樣中感興趣的一個(gè)區(qū)域是用于由操作者設(shè)定的初始偏移量，其中規(guī)定的焦平面上，并作為補(bǔ)償（圖7（a））的基礎(chǔ)上蓋玻片表面。當(dāng)焦點(diǎn)漂移時(shí)（在此，更接近客觀的蓋玻片的軸向運(yùn)動(dòng)，如圖7（b））的結(jié)果，檢測(cè)到的強(qiáng)度的激光或二極管反射從蓋玻片提供所需的信息來重新定位目標(biāo)，并恢復(fù)偏移補(bǔ)償。因此，電動(dòng)軸向?qū)箚卧邮盏姆答佈a(bǔ)償系統(tǒng)，以糾正檢測(cè)到的漂移在蓋玻片，然后恢復(fù)到預(yù)定義的軸向值偏移，提供銳聚焦的試樣（圖7（c）和圖7（d） ）。請(qǐng)注意，試樣本身是不參與聚焦校正，而上面的玻璃 - 水界面的反射控制這些設(shè)備所產(chǎn)生的干涉圖案。

的一個(gè)流行的，廉價(jià)的售后商業(yè)聚焦校正系統(tǒng)的操作，通過測(cè)量從蓋玻片使用全內(nèi)反射的近紅外LED光源的反射率的。這種設(shè)計(jì)在操作時(shí)非常有效地使用高數(shù)值孔徑物鏡（1.4或更高）一起可被改進(jìn)的聚焦控制電機(jī)，以*********微鏡幀。在使用全內(nèi)反射以評(píng)估焦點(diǎn)的主要限制是*的要求非常高數(shù)值孔徑的油浸目標(biāo)，以實(shí)現(xiàn)聚焦測(cè)量光束的入射角的臨界角。缺水和水浸泡的目標(biāo)，具有更小的數(shù)值孔徑，物鏡的數(shù)值孔徑必須顯著高于試樣及其周圍介質(zhì)中沐浴在生長(zhǎng)的活細(xì)胞（約1.33至1.38的折射率這一事實(shí)，本變形例中，由于不適合或成像介質(zhì)）。因此，雖然適合高分辨率活細(xì)胞成像調(diào)查的大多數(shù)，這個(gè)裝置是不是適用于水浸泡的情況下，或進(jìn)行高通量的考試，涉及多孔板和干目標(biāo)是至關(guān)重要的。另一個(gè)售后市場(chǎng)產(chǎn)品采用一個(gè)高分辨率的傳感器（5納米的精度）來衡量，以確定聚焦的物鏡前透鏡和被檢體之間的間距。在該裝置中，安裝在目標(biāo)的目標(biāo)線程和物鏡轉(zhuǎn)換器之間安裝一個(gè)壓電納米定位。的納米定位的運(yùn)動(dòng)范圍是大約100微米，這是足夠的，提供了廣闊的焦距范圍。

各大顯微鏡制造商在過去幾年已經(jīng)******一些商業(yè)焦點(diǎn)漂移補(bǔ)償裝置。所有這些系統(tǒng)的目的是利用近紅外光反射從的蓋玻片媒體接口在活細(xì)胞成像室確定的目標(biāo)之間的距離和蓋玻片，但沒有一個(gè)是適合使用高折射率的介質(zhì)中固定的標(biāo)本（接近1.5，的值大多數(shù)蓋玻片）。在操作過程中，通過專用的光學(xué)系統(tǒng)，其與主顯微鏡的光學(xué)列車相交源自激光或LED的線狀光，由物鏡聚焦上支持下觀察細(xì)胞的蓋玻片和介質(zhì)之間的界面。從該界面的反射光，然后傳送到校正光學(xué)系統(tǒng)的焦點(diǎn)和一個(gè)專門的，集成的電荷耦合器件（CCD）的表面上。CCD所獲取的反射光的強(qiáng)度和位置的基礎(chǔ)上，該軟件的反饋系統(tǒng)建立的玻璃-水界面或物鏡焦點(diǎn)之間的關(guān)系。

激活后的焦點(diǎn)校正硬件，操作員可以引入一個(gè)偏移移動(dòng)物鏡焦點(diǎn)的選擇區(qū)域內(nèi)的檢體的界面處，同時(shí)保持相同的參考點(diǎn)，從而提供清晰的對(duì)焦的試樣，在一個(gè)特定的界面距離的（見圖7）。因此，偏移值被定義為物鏡的焦平面之間的距離和水玻璃（或玻璃-空氣）接口邊界。根據(jù)制造商，這些重點(diǎn)補(bǔ)償系統(tǒng)能夠監(jiān)測(cè)和糾正焦點(diǎn)漂移在不同的時(shí)間尺度上，從幾毫秒到10秒或更長(zhǎng)時(shí)間不等。這提供了一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)，在基于軟件的聚焦補(bǔ)償例程。此外，在大多數(shù)情況下，注重漂移補(bǔ)償參數(shù)可以被定義在坐標(biāo)漂移校正圖像采集，以及將與其他外圍設(shè)備，如快門，濾光片輪，電動(dòng)載物臺(tái)的顯微鏡控制軟件。

長(zhǎng)期聚焦漂移硬件補(bǔ)償之前和之后的一個(gè)例子是圖8中的（一）。該標(biāo)本是貼壁培養(yǎng)的人類腫瘤細(xì)胞（HeLa細(xì)胞線），與EGFP融合了人α -微管蛋白的標(biāo)記。圖像被抓獲一個(gè)60X的油浸物鏡旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡的熒光照明下，在4分鐘的時(shí)間間隔四個(gè)小時(shí)。在飼養(yǎng)細(xì)胞在蓋玻片的溫度被保持在蓋玻片周圍的金屬的元素嵌入在一個(gè)電阻的加熱腔室。在顯微鏡實(shí)驗(yàn)室溫度下降一攝氏度，每小時(shí)的速度。過一段時(shí)間240分鐘，沒有硬件補(bǔ)償，焦平面的軸向位移約2.8微米。相反，在硬件焦點(diǎn)漂移校正，焦平面的精確度約200納米，在相同的時(shí)間內(nèi)保持。圖8（b）表示打開檢修門平衡至1分鐘，為期37攝氏度的環(huán)境室的影響。請(qǐng)注意突然浸在軸向位移（約3.4微米），溫度沖擊的結(jié)果發(fā)生。

國(guó)家的**的聚焦漂移補(bǔ)償硬件的一個(gè)例子是尼康**的對(duì)焦系統(tǒng)（PFS），這是融入軸向控制硬件的Ti-E系列倒置顯微鏡（如圖9所示）。廣泛的干式和油浸目標(biāo)，從4倍到100倍，具有不同數(shù)值孔徑，可以采用的Ti-E-PFS儀器聚焦補(bǔ)償。于加油站的目標(biāo)的工作距離范圍覆蓋120微米至*過15毫米，得到高度的通用性。近紅外線LED 870納米和加油站所使用的CCD行傳感器被安置在一個(gè)專門的物鏡轉(zhuǎn)換器單元（圖9），不需要無窮大的空間，使主顯微鏡的光學(xué)列車?yán)^續(xù)致力于成像。其中**的功能的尼康PFS為5毫秒（200赫茲）的采樣率，這是獨(dú)立的顯微鏡和相機(jī)控制軟件，大大快于其他系統(tǒng)，必須反復(fù)探測(cè)蓋玻片接口到焦平面利益。利用長(zhǎng)波長(zhǎng)的LED，可以使用在340和750納米之間的波長(zhǎng)范圍內(nèi)發(fā)射的熒光團(tuán)的Ti-E-PFS。此外，加油站可以使用種類繁多的對(duì)比增強(qiáng)成像模式，包括明場(chǎng)，相襯，霍夫曼調(diào)制相比之下，DIC，廣角熒光，激光共聚焦，TIRFM，旋轉(zhuǎn)盤，和線掃描后掠場(chǎng)。

上述的的聚焦漂移校正系統(tǒng)的設(shè)計(jì)主要是容納在專門的成像腔室蓋玻片的厚度范圍從150到180微米（＃1或＃1.5蓋玻片）配備圖像的活細(xì)胞。其他標(biāo)本可能要困難得多觀察焦點(diǎn)漂移校正由于微弱的紅外線反射或過度的散射光。這些包括高折射率的介質(zhì)（更緊密地匹配，在蓋玻片）被安裝在固定的標(biāo)本。在這種情況下，從聚焦監(jiān)控系統(tǒng)的反射光的量可能不足以檢測(cè)到的接口表面。同樣的，厚實(shí)的組織標(biāo)本，分散了大量的光，是很難用焦點(diǎn)漂移校正。厚玻璃蓋玻片（大于180微米）或塑料組織培養(yǎng)皿不推薦，因?yàn)榭赡軣o法檢測(cè)的邊界表面由于沒有足夠的偏移。*后，蓋玻片上表面的灰塵和碎片可以降低邊界檢測(cè)精度，導(dǎo)致過度捕獵或焦點(diǎn)校正錯(cuò)誤。

盡管目前可用的的焦點(diǎn)漂移校正系統(tǒng)的設(shè)計(jì)測(cè)量反射從蓋玻片接口，提供了眾多的選擇和潛在的缺陷的研究人員進(jìn)行長(zhǎng)期的時(shí)間推移成像的變化從一個(gè)設(shè)計(jì)到另一個(gè)。主要興趣是主要的商業(yè)系統(tǒng)之間的價(jià)格變化，從而使研究人員能夠在某些情況下，選擇一個(gè)解決方案，更緊密地與適合他們的預(yù)算比他們的實(shí)際活細(xì)胞成像需求。如上所討論的，一些廠家售后提供輔助聚焦校正單元可被改進(jìn)用于在現(xiàn)有的機(jī)動(dòng)（非機(jī)動(dòng)項(xiàng)目）的顯微鏡。與此相反，更精致的顯微鏡制造商所提供的交鑰匙系統(tǒng)完全集成到其反相的幀，因此不需要修改的光端口，用于安裝在顯微鏡或使用。所有的焦點(diǎn)校正系統(tǒng)能夠成像的多個(gè)特征在不同的橫向和軸向位置（實(shí)際上，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)為每一個(gè)拍攝的視場(chǎng)）。

評(píng)估商業(yè)焦點(diǎn)漂移校正系統(tǒng)時(shí)的一個(gè)主要考慮因素是反饋回路的頻率監(jiān)控和調(diào)整的重點(diǎn)。尼康PFS系統(tǒng)提供了一個(gè)持續(xù)活躍的機(jī)制，獨(dú)立的顯微鏡和相機(jī)控制軟件運(yùn)行，而其他每個(gè)圖像被捕獲之前，立即進(jìn)行重點(diǎn)檢測(cè)和校正過程。每種方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。例如，如果實(shí)驗(yàn)涉及實(shí)時(shí)圖像捕獲，然后的尼康PFS系統(tǒng)采用連續(xù)進(jìn)料的作用機(jī)制可能是更有用的，因?yàn)樗鼤?huì)漂移校正獨(dú)立軟件調(diào)用。然而，對(duì)于實(shí)驗(yàn)中捕捉圖像在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)間歇性是重要的考慮因素，速度較慢的系統(tǒng)評(píng)估焦點(diǎn)之前，每個(gè)圖像捕捉可能是足夠的。在一般情況下，在選擇的聚焦補(bǔ)償系統(tǒng)的首要考慮的是圖像被捕獲時(shí)的速度。更快的系統(tǒng)執(zhí)行以及在長(zhǎng)的時(shí)間間隔拍攝圖像，而較慢的系統(tǒng)將是用處不大的圖像捕獲的時(shí)間間隔短于3?5秒。

在典型的時(shí)間推移的情況下，其中一個(gè)顯著的延遲之間發(fā)生圖像捕獲，需要短的時(shí)間間隔來測(cè)量反射率，然后偏移到一個(gè)特定的軸向位置蓋玻片以上是無關(guān)緊要的。然而，當(dāng)收集流中的圖像的每秒30幀或更多的快速脈沖串時(shí)，*快的補(bǔ)償系統(tǒng)會(huì)顯示**的性能。然而，應(yīng)當(dāng)指出的是，根據(jù)設(shè)計(jì)，一個(gè)連續(xù)的反饋系統(tǒng)可能不能夠完成補(bǔ)償步驟，而系統(tǒng)仍然是狩獵的參考平面之間的每一個(gè)暴露在捕獲圖像的風(fēng)險(xiǎn)，因此可能會(huì)對(duì)。在這種情況下，產(chǎn)生的視頻經(jīng)常遭受播放時(shí)的抖動(dòng)工件（不可預(yù)知像素沿的橫向軸發(fā)生間歇每隔幾幀轉(zhuǎn)移）。連續(xù)捕獲驅(qū)動(dòng)聚焦補(bǔ)償系統(tǒng)之間進(jìn)行選擇應(yīng)考慮的另一個(gè)變量是總的實(shí)驗(yàn)時(shí)間。時(shí)間推移實(shí)驗(yàn)的范圍可以從幾秒到幾個(gè)小時(shí)甚至幾天的長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)的*后幾個(gè)小時(shí)或幾天，連續(xù)依靠壓電致動(dòng)器的反饋系統(tǒng)可能會(huì)受到機(jī)械漂移或滯后或蠕變由于定位不一致。在短期的實(shí)驗(yàn)中，這些文物的影響通?？梢院雎圆挥?jì)，但在長(zhǎng)時(shí)間的收購(gòu)，他們的貢獻(xiàn)可能是顯著的。

總之，解決問題的焦點(diǎn)漂移也許是*重要的進(jìn)步，在*近的歷史上已經(jīng)發(fā)生的活細(xì)胞成像。此工件必須始終在一個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)的時(shí)間推移成像更為明顯，當(dāng)使用高數(shù)值孔徑物鏡窄的焦點(diǎn)深度可以很容易地轉(zhuǎn)移絲毫的振動(dòng)或變化的溫度處理。焦點(diǎn)的漂移也是一個(gè)關(guān)鍵因素（以及一個(gè)相當(dāng)大的挑戰(zhàn)），以消除成像時(shí)，一個(gè)復(fù)雜的序列，在一個(gè)單一的試樣在每個(gè)時(shí)間間隔的側(cè)向和軸向位置。在大多數(shù)情況下，從顯微鏡制造商提供的新焦點(diǎn)的漂移補(bǔ)償系統(tǒng)能夠提供良好的校正，但在不同的水平速度。然而，無論儀器的復(fù)雜程度，與活細(xì)胞進(jìn)行延時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須密切關(guān)注支付漂移上述因素，包括熱的環(huán)境中，試樣攝像室，振動(dòng)，浸沒介質(zhì)，穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性。一旦所有的基本細(xì)節(jié)已經(jīng)得到解決，應(yīng)謹(jǐn)慎調(diào)查以優(yōu)異的成績(jī)回報(bào)。